[發明專利]一種分離和純化不同外泌體亞群的方法

有效

• 申請號: 201710502919.4
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107446879B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 王俊霞;徐領會;張煉輝
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

本發明公開了一種基于羥基磷灰石的分離和純化不同外泌體亞群的方法。首先從培養基或生物體液樣品中分離純化獲得總外泌體懸液，然后利用羥基磷灰石通過色譜分離獲得不同外泌體亞群，具體是將總外泌體懸液與羥基磷灰石混合，搖動條件下孵育后，轉移至親和層析柱，用低濃度磷酸鈉溶液洗滌，然后利用由低到高不同濃度的磷酸鈉溶液依次洗脫，得到的各洗脫液再經過除雜得到各不同的外泌體亞群。該方法簡單、快速，獲得的不同外泌體子類中所包含的蛋白、RNA和DNA分子等分布情況幾乎沒有重疊，且外泌體解吸過程溫和，獲得的外泌體可以進一步應用，該方法還可以用于特異性富集癌細胞分泌的外泌體。該方法具有很好的臨床使用基礎，具有很大的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域。更具體地，涉及一種分離和純化不同外泌體亞群的方法。

背景技術

外泌體（exosomes）是一種具有雙層質膜結構的微囊泡，直徑約為30-150nm，由細胞通過胞吐作用釋放至細胞間隙或體液中，其內含有多種來源細胞所特有的蛋白質、脂質和核酸等活性生物分子。

外泌體在癌癥的發病機制、癌細胞的轉移和一些退行性疾病中發揮一定的作用。它們在血液循環中的豐度隨著包括癌癥在內的疾病的增加而增加。例如，階段II到IV卵巢癌患者分泌外泌體的水平明顯高于正常對照組與早期階段的癌癥病人。大腸癌患者和肺癌患者也比對照健康人產生較高數量的外泌體。乳腺癌細胞相對正常乳腺上皮細胞也產生更多的外泌體?；谀[瘤細胞產生較高水平的外泌體，并且其內含有多種來源細胞所特有的蛋白質、脂質和核酸等活性生物分子，外泌體極有潛力成為一種非侵入性的癌癥診斷方法。

開發從細胞培養液或生物流體分離外泌體的有效的方法可以讓研究者更好地了解微囊泡的成分。雖然高速離心一直是實驗室中的“經典”的分離外泌體的方法，但它是一項費時費力的工作。市場上也有一些提取試劑盒，采用簡單的低速離心沉淀，然而，這樣提取的外泌體，包含很多雜蛋白，因此，只可以作為一種快速富集外泌體的工具。最近的報告表明，從生物合成、包含物和生物特性來看，外泌體是高度異質性的。目前在鑒定外泌體為基礎的生物標志物的研究中都是用總量的外泌體來進行的。嘗試分離不同子類的外泌體也只有兩種方法，一種方法是基于密度梯度超速離心法，這是一個漫長、艱苦而且產量較低的程序；另外一種方法是免疫沉淀，它只能選擇特定子類的外泌體，并且需要預先知道其表面蛋白和脂類的類型，采用嚴厲處理釋放抗體結合體，整個方法是費時且昂貴的。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有外泌體分離技術的缺陷和不足，提供一種用差別親和力羥基磷灰石分離外泌體亞群的新方法，該方法還可以用于特異性富集癌細胞分泌的外泌體。該方法能夠從細胞培養基或生物體液中簡單而快速的分離無雜蛋白的外泌體，且獲得的不同外泌體子類中所包含的蛋白、miRNA和DNAs分子等分布情況幾乎沒有重疊。

本發明的目的是提供一種基于羥基磷灰石的分離和純化不同外泌體亞群的方法。

本發明另一目的是提供所述方法在分離純化外泌體、分離純化外泌體亞群以及在特異性富集癌細胞分泌的外泌體方面的應用。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一種基于羥基磷灰石的分離和純化不同外泌體亞群的方法，也是一種特異性富集癌細胞分泌的外泌體的方法，包括如下步驟：

S1.從細胞培養液或生物體液中分離純化獲得總外泌體懸液；

S2.利用羥基磷灰石通過色譜分離獲得不同外泌體亞群。

具體優選地，步驟S2的具體方法是：

S21.將步驟S1獲得的總外泌體懸液與羥基磷灰石混合，搖動條件下孵育后，轉移至親和層析柱，用3～5mM磷酸鈉溶液（優選為5mM）洗滌；