[發(fā)明專利]一種分離和純化不同外泌體亞群的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710502919.4
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107446879B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王俊霞;徐領(lǐng)會;張煉輝
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.一種基于羥基磷灰石的分離和純化不同外泌體亞群的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.從樣品中分離純化獲得總外泌體懸液，所述樣品為細胞培養(yǎng)液或生物體液：

（1）當樣品為細胞培養(yǎng)液時：細胞培養(yǎng)液在4℃、200～800g下離心2～8min，上清液再在4℃、2000～3000g下離心10～20min，然后0.22微米孔徑濾膜過濾，采用超濾離心過濾管ultravel-100膜濃縮上清液，濃縮液經(jīng)尺寸排阻色譜法去除蛋白質(zhì)而獲得總外泌體懸液；

（2）當樣品為生物體液時：生物體液樣品在4℃、14000～17000g下離心30min，上清液經(jīng)尺寸排阻色譜法除蛋白質(zhì)而獲得總外泌體懸液；

S2.利用羥基磷灰石通過色譜分離獲得不同外泌體亞群：

S21.將步驟S1的總外泌體懸液與羥基磷灰石按照體積比1～5：1混合，50～180rpm搖動條件下孵育30～60min，轉(zhuǎn)移至親和層析柱，用3～5mM磷酸鈉溶液洗滌；

S22.然后利用由低到高不同濃度的磷酸鈉溶液依次洗脫，所述磷酸鈉溶液的濃度不低于10mM，得到的各洗脫液再經(jīng)過除雜得到各不同的外泌體亞群。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，（1）和（2）中所述尺寸排阻色譜法具體是上清液經(jīng)瓊脂糖凝膠填充柱純化，具體步驟為：將上清液轉(zhuǎn)移到一個填充柱，用 5mM磷酸鈉重復循環(huán)洗脫8次，第2～8次的洗脫液合并即為總外泌體懸液。

3.權(quán)利要求1所述方法在分離和純化外泌體方面的應(yīng)用，所述應(yīng)用為非疾病診斷目的的。

4.權(quán)利要求1所述方法在分離和純化外泌體亞群方面的應(yīng)用，所述應(yīng)用為非疾病診斷目的的。

5.權(quán)利要求1所述方法在特異性富集癌細胞分泌的外泌體方面的應(yīng)用，所述應(yīng)用為非疾病診斷目的的。