[發明專利]用于基因甲基化檢測的引物和探針、采樣方法、試劑盒

在審

• 申請號: 201710502734.3
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107164524A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 喻德華;梁秋菊
• 申請（專利權）人: 深圳市優圣康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，更具體地，是一種用于基因甲基化檢測的引物和探針、采樣方法、試劑盒。

背景技術

DNA甲基化水平和模式的改變是腫瘤發生的一個重要因素。基因啟動子高甲基化以后基因表達就會減弱甚至關閉，相當于基因的開關。惡性腫瘤中基因的開關多由DNA甲基化調控，幾乎所有腫瘤中都會伴隨DNA甲基化的異常改變，且常常高甲基化與低甲基化并存。如腫瘤細胞中抑癌基因啟動子通常為高甲基化，導致抑癌基因表達受抑制喪失抑癌功能，從而促進癌癥的發生。低甲基化通常是整個基因組低甲基化或原癌基因啟動子低甲基化，前者導致染色體結構穩定性降低，促進癌變發生，后者則會激活原癌基因，誘導細胞癌變。

SEPT9基因的V2轉錄本啟動子甲基化已被證實與CRC(結直腸癌)的發生密切相關，甲基化導致基因轉錄受到抑制，從而影響基因的正常表達，并使其抑癌功能喪失，影響囊泡運輸、絲狀結構形成、細胞分裂和凋亡等功能。大量臨床研究證實，不同于正常結直腸組織，CRC組織中可檢出明顯異常的SEPT9基因甲基化，SEPT9基因甲基化是CRC早期發生、發展過程中的特異性分子標記物。SEPT9甲基化檢測可檢出70％以上的早期結直腸患者，可大大降低結直腸癌患者的死亡率。2016年4月美國FDA(美國食品藥物管理局)已經批準該項檢查應用于臨床。

DNA甲基化的檢測大體分為兩個步驟：1.待檢測樣品的前期處理；2.目標序列的定位和甲基化狀態的量化。DNA甲基化預處理方式主要分為三種：1.限制性內切酶法；2.蛋白或抗體富集；3重亞硫酸鹽轉化法。以重亞硫酸鹽預處理法應用最為廣泛。DNA經亞硫酸氫鈉預處理后，非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶，對其進行PCR擴增的話進一步將模板上的尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶。而甲基化的胞嘧啶不受亞硫酸氫鈉影響，保持不變。這樣DNA片段甲基化狀態的差異轉化為堿基序列的差異。通過區分后者就可間接判斷樣品中的胞嘧啶是否甲基化。

目前檢測特異性位點的甲基化的方法主要有以下幾種：

(1)結合重亞硫酸鹽的直接測序法(Bisulfite sequencing,BSP)

該方法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變；用PCR擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后，對PCR產物進行克隆測序并且與未經處理的序列比較,判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法是精確度很高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序，不易大批量操作，過程較為繁瑣、昂貴。

(2)甲基化特異性的PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)

該方法先將DNA重亞硫酸鹽處理，隨后進行引物特異性的PCR。其設計兩對引物，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結合處理后的甲基化DNA鏈，另一對結合處理后的非甲基化DNA鏈。電泳檢測MS-PCR擴增產物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；反之亦然。這種方法引物設計至關重要，設計不好容易有假陽性；只能做定性研究，即只能明確是否存在甲基化。且需電泳分離檢測，容易污染。

(3)甲基化熒光法(MethyLight)

結合重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5′端連接報告熒光，3′端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，Taq DNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性會將探針序列上5′端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平。本方法高效，迅速，具備可重復、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。缺點是測定每個位點需要一對引物和標有熒光素的探針，探針無法檢出雜合甲基化，只適用于少數位點大量樣本篩查。

(4)甲基化敏感的高分辨率熔解曲線分析(Methylation-sensitive high-resolution melting,MS-HRM)

亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發現，因為甲基化DNA含有更多的GC，相對更難熔解。根據熔解溫度及峰型的變化，可輕易區分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技術可檢出極微小的差別。