[發(fā)明專利]一種白葉枯病抗性蛋白及編碼基因

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710500554.1
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107267523A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅瓊;曾千春;楊睿;張慧;楊靜;蘇延紅;安星宇;卓曉軒
• 申請（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/84;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 成都環(huán)泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)51242
• 代理人: 鄧瑞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因?qū)W技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種白葉枯病抗性蛋白及編碼基因。

背景技術(shù)

水稻對世界糧食安全具有舉足輕重的作用。水稻白葉枯病(Bacterial Blight) 是世界水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，可造成20-30％的產(chǎn)量損失，甚至顆粒無收。優(yōu)異白葉枯病抗性基因的克隆和應(yīng)用是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。但已鑒定或克隆的白葉枯病抗性基因在抗病育種中的應(yīng)用非常有限，如Xa1、Xa10、Xa11和Xa18等抗菌譜窄，對我國絕大多數(shù)白葉枯病菌系都不抗(Bhasin et ai.,2012),xa5、xa8、xa13、xa19和xa20等抗病基因雖然抗譜廣，但又是隱性基因，難以用于雜交水稻育種(Kameswara et al.,2002；鮑思元等，2010)。目前抗病育種中應(yīng)用的主要抗病基因有Xa1、Xa3、Xa4、Xa21和Xa23，但由于品種的推廣種植過程中，田間病原菌群體的變異和新優(yōu)勢小種的出現(xiàn)，攜帶Xa1、 Xa3、Xa4抗病基因的主栽品種抗性逐漸喪失(曾列先等,2005；余滕瓊等，2005)。所以目前水稻抗病育種利用的白葉枯病抗性基因資源主要是Xa21和Xa23，抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗性容易喪失，大面積推廣應(yīng)用，使水稻生產(chǎn)和世界糧食安全存在潛在的巨大風(fēng)險(xiǎn)。

栽培稻抗白葉枯病遺傳資源狹窄，可挖掘和利用的白葉枯病抗性基因非常有限，很難發(fā)掘到新的優(yōu)異抗病基因。疣粒野生稻(O.meyeriana)是我國現(xiàn)有三種野生稻資源之一，主要分布在云南熱帶和海南西南部地區(qū)，具有高抗甚至免疫白葉枯病菌的特性，蘊(yùn)藏著許多栽培稻不具備的優(yōu)異基因資源(Aggarwal et al.,1997；錢韋等,2001；云勇和韓義勝,2014；楊睿等，2015)。所以疣粒野生稻中優(yōu)異廣譜抗白葉枯病新基因的鑒定和利用，不僅能擴(kuò)大栽培稻的抗性遺傳基礎(chǔ)，而且對水稻白葉枯病抗性機(jī)制研究、水稻抗性育種和白葉枯病的防治具有十分重要的意義。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：目前水稻抗病育種利用的白葉枯病抗性基因資源主要是Xa21和Xa23，抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗性容易喪失，大面積推廣應(yīng)用，使水稻生產(chǎn)和世界糧食安全存在潛在的巨大風(fēng)險(xiǎn)；疣粒野生稻為GG 基因組，與栽培稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，無法通過常規(guī)的雜交方法轉(zhuǎn)移和利用疣粒野生稻中的優(yōu)良抗病基因。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種白葉枯病抗性蛋白及編碼基因。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，依托云南疣粒野生稻的資源優(yōu)勢，在NSFC-云南聯(lián)合基金的資助下，利用二代測序技術(shù)進(jìn)行疣粒野生稻轉(zhuǎn)錄組測序和CDS文庫構(gòu)建，通過cDNA序列同源搜索和3'/5'RACE-PCR方法從疣粒野生稻中克隆了一個(gè)白葉枯病抗性蛋白編碼基因，所述白葉枯病抗性蛋白編碼基因的cDNA序列為SEQIDNO:1。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的白葉枯病抗性蛋白的氨基酸序列為 SEQIDNO:2。

本發(fā)明的另一目的在于提供基因過表達(dá)載體為：pCAMBIA1300-Om46055；所述過表達(dá)基因的DNA序列為SEQIDNO:3。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種白葉枯病抗性蛋白編碼基因的克隆方法包括：

Om46055全長cDNA的獲得：

提取疣粒野生稻葉和幼穗組織的mRNA，利用二代測序技術(shù)進(jìn)行RNA-seq，從已克隆的白葉枯病抗性基因Xa1、xa5、xa13、Xa21、Xa23、Xa3/Xa26和Xa27 的CDS序列，通過與疣粒野生稻轉(zhuǎn)錄組測序預(yù)測的蛋白編碼框CDS建立的本地文庫進(jìn)行同源性比對，e值限制是1e-5；得到一條632bp的cDNA序Om46055；

根據(jù)Om46055的序列設(shè)計(jì)引物，采用3'/5'RACE-PCR方法從疣粒野生稻中克隆Om46055的全長。

進(jìn)一步，所述克隆Om46055的全長的方法包括：

步驟一，5’RACE：提取高質(zhì)量的疣粒野生稻葉和幼穗總RNA，并將總RNA 通過采用RACE 5’/3’Kit轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；然后以第一鏈cDNA 為模板，用基因特異引物5’RACE-Om46055 Primer與試劑盒中自帶的通用接頭引物Universal Long Primer，通過Seq Amp DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接到pUC19-based載體進(jìn)行測序拼接；所述5’RACE- Om46055 Primer的DNA序列為SEQIDNO:4；所述引物Universal Long Primer的 DNA序列為SEQIDNO:5；