[發明專利]一種白葉枯病抗性蛋白及編碼基因

在審

• 申請號: 201710500554.1
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107267523A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 羅瓊;曾千春;楊睿;張慧;楊靜;蘇延紅;安星宇;卓曉軒
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/84;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 成都環泰知識產權代理事務所(特殊普通合伙)51242
• 代理人: 鄧瑞

1.一種白葉枯病抗性蛋白編碼基因，其特征在于，所述白葉枯病抗性蛋白編碼基因的cDNA序列為SEQIDNO:1。

2.一種利用權利要求1所述白葉枯病抗性蛋白編碼基因編碼的新的白葉枯病抗性蛋白，其特征在于，所述新的白葉枯病抗性蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:2。

3.一種利用權利要求1所述白葉枯病抗性蛋白編碼基因構建的過表達載體，其特征在于，所述過表達載體為：pCAMBIA1300-Om46055；所述過表達基因的DNA序列為SEQIDNO:3。

4.一種如權利要求1所述白葉枯病抗性蛋白編碼基因的克隆方法，其特征在于，所述白葉枯病抗性蛋白編碼基因的克隆方法包括：

Om46055全長cDNA的獲得：

提取疣粒野生稻葉和幼穗組織的mRNA，利用二代測序技術進行RNA-seq，根據已克隆的白葉枯病抗性基因Xa1、xa5、xa13、Xa21、Xa23、Xa3/Xa26和Xa27的CDS序列，通過與疣粒野生稻轉錄組測序預測的蛋白編碼框CDS建立的本地文庫進行同源性比對，e值限制是1e-5；得到一條632bp的cDNA序Om46055；

根據Om46055的序列設計引物，采用3'/5'RACE-PCR方法從疣粒野生稻中克隆Om46055的全長。

5.如權利要求4所述的白葉枯病抗性蛋白編碼基因的克隆方法，其特征在于，所述克隆Om46055的全長的方法包括：

步驟一，5’RACE：提取高質量的疣粒野生稻葉和幼穗總RNA，并將總RNA通過采用RACE 5’/3’Kit轉錄合成第一鏈cDNA；然后以第一鏈cDNA為模板，用基因特異引物5’RACE-Om46055Primer與試劑盒中自帶的通用接頭引物Universal Long Primer，通過Seq Amp DNA Polymerase進行擴增反應；將擴增產物切膠回收后連接到pUC19-based載體進行測序拼接；所述5’RACE-Om46055Primer的DNA序列為SEQIDNO:4；所述引物Universal Long Primer的DNA序列為SEQIDNO:5；

步驟二，3’RACE：提取高質量的疣粒野生稻葉和幼穗總RNA，并將總RNA通過采用RACE 5’/3’Kit轉錄合成第一鏈cDNA；然后以第一鏈cDNA為模板，用基因特異引物3’RACE-Om46055Primer與試劑盒中自帶的通用接頭引物Universal Long Primer，通過Seq Amp DNA Polymerase進行擴增反應；將擴增產物切膠回收后連接到pUC19-based載體進行測序拼接；所述3’RACE-Om46055Primer的DNA序列為SEQIDNO:6:

步驟三，ORF擴增：以高質量的疣粒野生稻葉和幼穗總RNA為模板，采用II First-stand cDNA Synthesis SuperMix進行總RNA反轉錄合成第一鏈cDNA；以第一鏈cDNA為模板，用Om46055-ORF-F和Om46055-ORF-R引物進行PCR擴增；將PCR擴增產物連接到pEASY Blant Simple載體進行測序；所述Om46055-ORF-F的DNA序列為SEQIDNO:7；所述Om46055-ORF-R的DNA序列為SEQIDNO:8；

將步驟一、步驟二和步驟三的序列進行拼接，得到Om46055的全長cDNA序列。

6.一種利用權利要求3所述白葉枯病抗性蛋白編碼基因的過表達載體轉入水稻日本晴獲得的轉基因植株，其特征在于，所述轉基因植株為Om46055-ox；轉基因植株獲得的方法包括：

Om46055基因編碼區的全長cDNA通過Seamless Assembly Cloning Kit連接到表達載體pCAMBIA1300，構建過表達載體pCAMBIA1300-Om46055；過表達載體通過電擊轉化法轉入根癌農桿菌EHA105感受態中，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法轉入感病材料日本晴愈傷組織中，誘導分化成苗。