[發明專利]利用CRISPR-CAS9技術敲除NRK細胞Slc22a2基因的方法

有效

• 申請號: 201710496608.1
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107177631B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 許文濤;羅云波;祁瀟哲;黃昆侖;朱麗葉;賀曉云
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/113
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明提供一種利用CRISPR?CAS9技術敲除NRK細胞Slc22a2基因的方法。根據大鼠Slc22a2基因序列，構建基于CRISPER?Cas9系統的gRNA表達載體，以此作為Slc22a2基因打靶載體，轉入NRK細胞中，獲得Slc22a2基因敲除的NRK細胞，其可作為理想的細胞模型，模擬人體腎臟環境中OCT2蛋白的缺失，用于研究OCT2蛋白在藥物、毒素以及其他小分子物質轉運方面的應用。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及一種利用CRISPR-CAS9技術敲除NRK細胞Slc22a2基因的方法。

背景技術

NRK-52E細胞是大鼠腎小管上皮細胞，很多藥物、毒素的分泌、吸收都在腎小管上皮細胞完成。在腎臟中有很多轉運蛋白在藥物、毒素的分泌、吸收中發揮著重要作用。有機陽離子轉運蛋白家族(OCTs)是跨膜蛋白，包括三個亞型1-3，由SLC22A1-3編碼，轉運有機陽離子、弱堿和一些中性化合物。人OCT1主要在肝臟表達，將血液中的有機陽離子轉運進肝臟，然后再進行生物轉化。OCT2主要分布于腎臟和腦部，參與藥物、毒素腎清除和腦轉運。OCT3在多種組織中都有表達，例如腎、肝、小腸、腦、骨骼肌、胎盤等，負責中樞神經系統中內源物質的轉運。

在該家族成員中，OCT2(基因Slc22a2)在人腎近端小管細胞基底膜表達豐富，所以有可能他們在近端小管從血液吸收化合物的過程中起重要作用。人OCT2和大鼠OCT2均位于腎近端小管基底膜，參與許多化合物腎排泄和腎重吸收。人OCT2轉運四乙胺、1-甲基-4-苯基吡啶、4-[4-(二甲氨基)苯乙烯基]-N-甲基吡啶、N-甲基煙酰胺、氨基胍。OCT2還轉運神經遞質，例如乙酰膽堿、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、5-羥色胺、組胺、膽堿。人OCT2也轉運黃曲霉毒素B1、百草枯、溴化乙錠。一些蛋白參與了OCT2的轉錄后調控，如蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、鈣調蛋白。OCT2介導許多藥物腎外排的第一步，以及膽堿或其他有機陽離子底物在近端小管重吸收的第二步。人中樞神經系統中的OCT2能將藥物轉運通過血腦屏障，例如抗帕金森的藥物。在急性和慢性腎損傷中，腎OCT2蛋白表達下降，會導致OCT2底物的藥代動力學和腎毒性的改變。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用CRISPR-CAS9技術敲除NRK細胞Slc22a2基因的方法。

本發明的另一目的是提供利用上述方法制備的Slc22a2基因敲除的NRK細胞系及以其作為細胞模型在研究OCT2蛋白的轉運功能中的應用。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種Slc22a2基因打靶載體，所述打靶載體是基于CRISPR/Cas9系統的gRNA表達載體，gRNA作用位點位于大鼠Slc22a2基因的2號外顯子上，gRNA作用位點的DNA序列為5′-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3′(SEQ ID NO:1)。

用于構建所述表達載體的出發載體為pX458。

所述表達載體其是將gRNA作用位點的DNA序列5′端加上BbsI酶切位點序列，并人工合成其互補序列，將兩條互補序列形成的雙鏈DNA，與經過BbsI酶切的pX458載體連接，構建得到的。

本發明還提供所述打靶載體在制備Slc22a2基因敲除的NRK細胞系中的應用。

本發明還提供一種利用CRISPR-CAS9技術敲除NRK細胞Slc22a2基因的方法，其是根據大鼠Slc22a2基因序列，構建基于CRISPER-Cas9系統的gRNA表達載體，以此作為Slc22a2基因打靶載體，轉入NRK細胞中，獲得Slc22a2基因敲除的NRK細胞。

其中，gRNA作用位點位于大鼠Slc22a2基因的2號外顯子上，gRNA作用位點的DNA序列為5′-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3′。