[發(fā)明專(zhuān)利]新型抗菌肽DLP2的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710496606.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107267547A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建華;李占占;毛若雨;滕達(dá);王秀敏;郝婭
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京生泰云科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/81
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K1/18;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種新型抗菌肽DLP2的制備方法。

背景技術(shù)

黑水虻抗菌肽DLP2是Sung Moon Yoe研究組以黑水虻(亮斑扁角水虻，Hermetia illucens)為原料，通過(guò)金黃色葡萄球菌(S.aureus KCCM 40881)進(jìn)行免疫刺激從而產(chǎn)生的高效抗G⁺菌活性抗菌肽。抗菌肽DLP2是含有95個(gè)氨基酸殘基的多肽序列，其中1～24位是信號(hào)肽序列，25～40位為前導(dǎo)肽序列，41～81位為成熟肽(DLP2)序列。DLP2理論分子量分別為4277.0Da，分子中具有2個(gè)組氨酸(His)和1個(gè)賴(lài)氨酸(Lys)以及5個(gè)精氨酸(Arg)，在不同pH環(huán)境中，由于組氨酸解離狀態(tài)不同，凈電荷數(shù)在+2到+4之間變化(Soon-Ik Park等，Park S I,Kim J W,Yoe S M.Purification and characterization of a novel antibacterial peptide from black soldier fly(Hermetia illucens)larvae.[J].Developmental&Comparative Immunology,2015,52(1):98-106.)。

抗菌肽替代傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用于由細(xì)菌感染所引起的各種疾病一直備受科學(xué)界關(guān)注，也是人類(lèi)對(duì)抗各種病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌譜過(guò)寬，穩(wěn)定性不好，具有細(xì)胞毒性，抗菌活性不足，用藥多樣性，生產(chǎn)成本高(基因克隆表達(dá)產(chǎn)量太低和化學(xué)合成成本過(guò)高)等一直是抗菌肽應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。目前，尚未見(jiàn)到有關(guān)于DLP2在畢赤酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供新型抗菌肽DLP2的制備方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種可高效分泌表達(dá)抗菌肽DLP2的重組酵母菌。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的新型抗菌肽DLP2的制備方法，包括以下步驟：

1)基因表達(dá)框的設(shè)計(jì)：對(duì)抗菌肽DLP2的編碼基因進(jìn)行酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化，在優(yōu)化后的基因序列的5’端添加X(jué)hoI酶切位點(diǎn)和Kex2切割位點(diǎn)，在3’端添加TAA和TAG終止子序列以及XbaI酶切位點(diǎn)，所得基因表達(dá)框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建：將SEQ ID No:3所示的基因經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切后，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pPICZαA載體連接，得到的重組酵母表達(dá)載體pPICDLP2；

3)重組酵母菌的制備：載體pPICDLP2經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母X-33，篩選出高水平表達(dá)抗菌肽DLP2的重組酵母菌；

4)抗菌肽DLP2的制備：對(duì)步驟3)中獲得的重組酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖和甲醇誘導(dǎo)，獲得發(fā)酵液，離心收集上清，上清經(jīng)純化后即得抗菌肽DLP2。

前述的方法，步驟4)具體為：

①種子液制備：

挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，28～30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)18～24h；然后按1％的接種量，轉(zhuǎn)接至YPD培養(yǎng)基中，28～30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)16～18h，OD₆₀₀達(dá)到4～6；然后，按10％接種量接到上罐培養(yǎng)基(含4.8‰PMT1)中，即200ml菌液+200ml 45％葡萄糖+9.6ml PMT1，裝液量為2L/5L，于29℃，800rpm，pH 5.0，pO₂>35％的條件下培養(yǎng)16-18h；

②添加葡萄糖生長(zhǎng)階段：

觀測(cè)發(fā)酵液的溶氧值開(kāi)始緩慢下降后突然上升，開(kāi)始補(bǔ)加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加時(shí)間6-8h，流速為30ml/L/h；

③甲醇過(guò)渡誘導(dǎo)：

添加葡萄糖6h后，饑餓1h，待葡萄糖耗盡后，開(kāi)始補(bǔ)加含12‰PMT1的無(wú)水甲醇，補(bǔ)加過(guò)程中，流速由第1小時(shí)1ml/L/h逐漸增加到第6小時(shí)6ml/L/h，直至發(fā)酵結(jié)束；

④100％甲醇誘導(dǎo)階段：

甲醇過(guò)渡誘導(dǎo)6h后，開(kāi)始100％甲醇連續(xù)誘導(dǎo)，流速為6ml/L/h；甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始后，每12h取樣，測(cè)定重組酵母菌分泌表達(dá)抗菌肽DLP2的水平。

前述的方法，步驟4)中采用陽(yáng)離子交換層析對(duì)上清進(jìn)行純化。具體操作如下：