[發明專利]新型抗菌肽DLP2的制備方法

在審

• 申請號: 201710496606.2
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107267547A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 王建華;李占占;毛若雨;滕達;王秀敏;郝婭
• 申請（專利權）人: 北京生泰云科技有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K1/18;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

1.新型抗菌肽DLP2的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)基因表達框的設計：對抗菌肽DLP2的編碼基因進行酵母偏愛密碼子優化，在優化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位點和Kex2切割位點，在3’端添加TAA和TAG終止子序列以及XbaI酶切位點，所得基因表達框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)重組酵母表達載體的構建：將SEQ ID No:3所示的基因經XhoI和XbaI雙酶切后，與經過同樣雙酶切的pPICZαA載體連接，得到的重組酵母表達載體pPICDLP2；

3)重組酵母菌的制備：載體pPICDLP2經線性化后轉化感受態畢赤酵母X-33，篩選出高水平表達抗菌肽DLP2的重組酵母菌；

4)抗菌肽DLP2的制備：對步驟3)中獲得的重組酵母菌進行發酵培養，通過補加葡萄糖和甲醇誘導，獲得發酵液，離心收集上清，上清經純化后即得抗菌肽DLP2。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)具體為：

①種子液制備：

挑取單菌落接種于YPD培養基中，28～30℃，250rpm振蕩培養18～24h；然后按1％的接種量，轉接至YPD培養基中，28～30℃，250rpm振蕩培養16～18h，OD₆₀₀達到4～6；然后，按10％接種量接到上罐培養基中，即200ml菌液+200ml 45％葡萄糖+9.6ml PMT1，裝液量為2L/5L，于29℃，800rpm，pH 5.0，pO₂>35％的條件下培養16-18h；

②添加葡萄糖生長階段：

觀測發酵液的溶氧值開始緩慢下降后突然上升，開始補加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加時間6-8h，流速為30ml/L/h；

③甲醇過渡誘導：

添加葡萄糖6h后，饑餓1h，待葡萄糖耗盡后，開始補加含12‰PMT1的無水甲醇，補加過程中，流速由第1小時1ml/L/h逐漸增加到第6小時6ml/L/h，直至發酵結束；

④100％甲醇誘導階段：

甲醇過渡誘導6h后，開始100％甲醇連續誘導，流速為6ml/L/h；甲醇誘導開始后，每12h取樣，測定重組酵母菌分泌表達抗菌肽DLP2的水平。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中采用陽離子交換層析對上清進行純化。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，陽離子交換層析純化的具體操作如下：

發酵液于4℃，12000rpm離心10min后取上清，將長度16mm、內徑10mm的HiPrep SP FF陽離子交換柱用A液平衡5-10個柱體積后上樣；進樣完畢后，先用A液進行洗脫，待穿透峰洗脫完后，用B液進行洗脫，收集洗脫峰；

洗脫步驟為：100％A液，洗脫5個柱體積，為穿透峰；40％A，60％B液，洗脫5個柱體積，為洗脫峰；利用UV215nm監測洗脫情況，Tricine-SDS-PAGE和檢測目標產物純化情況；其中，所述A液為20mM，pH7.0的磷酸鹽洗脫緩沖液，所述B液為含有1M NaCl的20mM，pH7.0的磷酸鹽洗脫緩沖液；

收集到的洗脫峰，經1KDa截留分子量透析袋4℃透析，每2h換水一次，換水6次；收集透析后的透析液，于-54℃，0.016MPa條件下進行真空冷凍干燥，通過Tricine-SDS PAGE凝膠電泳檢測純化后的抗菌肽DLP2。

5.一種分泌表達抗菌肽DLP2的重組酵母菌，其構建方法包括以下步驟：

1)對抗菌肽DLP2的編碼基因進行酵母偏愛密碼子優化，在優化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位點和Kex2切割位點，在3’端添加TAA和TAG終止子序列以及XbaI酶切位點，所得基因表達框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)將SEQ ID No:3所示的基因經XhoI和XbaI雙酶切后，與經過同樣雙酶切的pPICZαA載體連接，得到的重組酵母表達載體pPICDLP2；

3)載體pPICDLP2經線性化后轉化感受態畢赤酵母X-33，即得分泌表達抗菌肽DLP2的重組酵母菌。