[發明專利]一種過表達MGST1基因人肺腺癌細胞的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201710491161.9
• 申請日: 2017-06-24
• 公開（公告）號: CN107937436A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 宋鑫;曾寶真;葛春蕾;孟旭東
• 申請（專利權）人: 信雅生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 上海宣宜專利代理事務所(普通合伙)31288
• 代理人: 劉君

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體的，涉及一種能夠過表達MGST1基因的人肺腺癌細胞的構建方法及其應用。

背景技術

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率在我國及全世界均高居首位。肺癌按病理組織類型分為兩種，即非小細胞肺癌

(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，其中NSCLC約占肺癌類型的80％。肺腺癌是最常見的NSCLC組織類型之一，其發現時常處于晚期，預后較差，因肺腺癌而造成的死亡數居我國所有癌癥相關性死亡數的第一位。針對肺癌的治療手段主要有手術、化療、放療、靶向治療和生物治療，雖然近年療效有較大的進展，但5年生存率仍不足15％，預后較差。因此探索肺腺癌的發病機制，探尋治療肺腺癌新的治療靶點具有重大意義。

基因工程(genetic engineering)，又稱為基因重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎在體外對DNA進行操作的一門技術，廣泛用于疾病基礎研究、基因免疫、基因治療、基因疫苗等。其三要素分別為：載體、目的基因、工具酶。而真核表達載體是基因工程中用于構建真核基因表達系統的一種載體，近幾十年來，各國學者圍繞真核表達載體進行了各種疾病、基因等相關研究，在基因工程方面做了大量工作，為醫學科學研究開辟了嶄新途徑。

MGST1基因編碼的蛋白在肝臟中高表達，通過催化親核性的谷胱甘肽和各種親電子試劑的結合反應發揮解毒作用，因此，MGST1在腫瘤化療藥物耐藥方面研究較多。近幾年研究報道MGST1在食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中表達增高，其機制未闡明，同時其在人肺癌中的研究未見報道。

鑒于以上MGST1在其他的惡行腫瘤中高表達的現象，以及基因重組技術的優勢，同時為了對肺腺癌細胞進行更多的研究，本發明采用基因重組技術，針對MGST1基因，構建重組真核表達載體pcDNA3-MGST1，并將其轉染低表達MGST1的人肺腺癌細胞，構建穩定轉染MGST1基因的細胞株，為研究MGST1功能提供了良好工具，亦為進一步研究MGST1基因在肺腺癌等惡性腫瘤中的生物學功能打下基礎，同時也為研究肺腺癌及其它惡性腫瘤中MGST1基因的功能提供有效實驗方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型的穩定過表達真核重組質粒的肺腺癌細胞及其制備方法，并證明所述穩定過表達重組質粒pcDNA3-MGST1的肺腺癌細胞為功能研究提供了良好的實驗工具，也為研究人肺腺癌及其它惡性腫瘤中MGST1基因的功能提供有效實驗方法。

人MGST1基因已在GenBank注冊，注冊號NM_001260511.1，定位于12p12.3，全長937bp，編碼155個氨基酸，其核苷酸序列為圖10中所述。我們前期研究結果發現人MGST1基因在人肺腺癌組織中高表達。本發明所述的真核重組質粒，由圖11所示的核苷酸序列中的MGST1目的片段與真核載體pcDNA3構建而成，所述MGST1目的片段是起始密碼子下游84bp～551bp的核苷酸序列。

一種pcDNA3-MGST1真核重組質粒轉染SPC-A-1細胞的方法，其包括如下步驟：

(1)通過PCR(聚合酶鏈式反應)合成人的MGST1目的基因片段；

(2)將上述獲得的MGST1目的基因片段與真核質粒pcDNA3連接，形成真核重組質粒，其中該插入MGST1目的基因的酶切位點分別為HindⅢ和KpnⅠ。將上述真核重組質粒轉化到感受態細菌細胞中進行培養，然后挑選出單克隆進行PCR凝膠電泳進行陽性克隆的篩選；

(3)抽提上一步中篩選出來的陽性克隆，利用限制性內切酶酶切圖譜分析所建的真核重組質粒，并進行DNA序列分析。

(4)將上一步中獲得序列正確的重組質粒pcDNA3-MGST1轉染SPC-A-1人肺腺癌細胞，并用G418篩選穩定過表達MGST1的SPC-A-1細胞，觀察穩定過表達MGST1的細胞生物學特性。

(5)實驗表明，穩定過表達MGST1可促進人肺腺癌細胞SPC-A-1的增殖，抑制人肺腺癌細胞SPC-A-1的凋亡。

由此可見，采用本發明的構建穩定過表達MGST1基因細胞的方法，有助于研究MGST1基因功能，并且為研究MGST1基因在人肺腺癌中發病的作用機制提供了分子生物學工具。

附圖說明

圖1為本發明真核重組質粒的載體pcDNA3的結構示意圖。

圖2為電泳測試圖譜。其中，