[發(fā)明專利]一種過表達(dá)MGST1基因人肺腺癌細(xì)胞的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710491161.9
• 申請(qǐng)日: 2017-06-24
• 公開（公告）號(hào): CN107937436A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋鑫;曾寶真;葛春蕾;孟旭東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 信雅生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 上海宣宜專利代理事務(wù)所(普通合伙)31288
• 代理人: 劉君

1.一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因細(xì)胞的方法，其包括如下步驟：

(1)通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))合成人的MGST1目的基因片段；

(2)將上述獲得的MGST1目的基因片段與真核質(zhì)粒pcDNA3連接，形成真核重組質(zhì)粒，其中該插入MGST1目的基因的酶切位點(diǎn)分別為Hind III和Kpn I。將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后挑選出單克隆進(jìn)行PCR凝膠電泳進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選；

(3)抽提上一步中篩選出來的陽(yáng)性克隆，利用限制性內(nèi)切酶雙酶切圖譜分析所建的真核重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析。

(4)將上一步中獲得的序列正確的重組質(zhì)粒pcDNA3-MGST1轉(zhuǎn)染SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞，并用G418篩選穩(wěn)定過表達(dá)MGST1的SPC-A-1細(xì)胞，觀察穩(wěn)定過表達(dá)MGST1的細(xì)胞生物學(xué)特性。

2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的MGST1目的基因片段的獲取包括如下步驟：

Step1：設(shè)計(jì)MGST1過表達(dá)的引物。

Step2：通過PCR合成MGST1目的基因。

Step3：純化回收PCR產(chǎn)物。

3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因細(xì)胞的方法，其特征在于：所述的MGST1過表達(dá)的引物為

上游引物：5′-CCCAAGCTTGGCTTGCTGCTTCCTCCTC-3′(含Hind III限制酶切位點(diǎn)CCCAAGCTT)

下游引物：5′-CGGGGTACCCCTCTGCTCCCCTCCTACCT-3′(含Kpn I限制酶切位點(diǎn)CGGGGTACC)。

4.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因細(xì)胞的方法，其特征在于：所述的步驟(1)中還包含PCR產(chǎn)物鑒定過程，所述的PCR產(chǎn)物的鑒定方法為，PCR產(chǎn)物電泳后在616bp處獲得擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，且該P(yáng)CR產(chǎn)物與用primer premier 5軟件設(shè)計(jì)的目的基因片段大小基本一致。

5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因細(xì)胞的方法，其特征在于：所述的步驟(2)包含如下步驟：

Step1：對(duì)載體pcDNA3和目的基因MGST1進(jìn)行酶切反應(yīng)。

Step2：回收酶切反應(yīng)產(chǎn)物。

Step3：MGST1目的基因片段與真核質(zhì)粒pcDNA3連接。

Step4：用MGST1-pcDNA3轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因細(xì)胞的方法，其特征在于：所述的感受態(tài)細(xì)胞為DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

7.研究權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定過表達(dá)的MGST1基因細(xì)胞的驗(yàn)證方法，包括：Real Time QPCR和Western bolt。

8.研究權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定過表達(dá)的MGST1基因細(xì)胞的生物學(xué)特性的方法，，其特征在于：需要觀察過表達(dá)MGST1的基因后對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1增殖情況的影響。

9.研究權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定過表達(dá)的MGST1基因細(xì)胞的生物學(xué)特性的方法，其特征在于：需要觀察過表達(dá)MGST1的基因后對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1克隆形成能力的影響。

10.研究權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定過表達(dá)的MGST1基因細(xì)胞的生物學(xué)特性的方法，其特征在于：需要觀察過表達(dá)MGST1的基因后對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1凋亡的影響。