[發(fā)明專利]檢測(cè)DNA甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710487933.1
• 申請(qǐng)日: 2017-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN107236808B
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李淑瑾;叢斌;付光平;徐潔;張倩;杜情情
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6869
• 代理公司: 13120 石家莊國(guó)為知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所
• 代理人: 王麗巧<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入

1.一種檢測(cè)DNA甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒，其特征在于，包括：血液DNA提取試劑盒、DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒、PCR緩沖溶液、引物、焦磷酸測(cè)序試劑盒、磁珠、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、退火緩沖液和變性緩沖液；所述引物包括分別對(duì)應(yīng)靶序列IGS3、IGS4、IGS5和IGS6，用于PCR擴(kuò)增的上下游引物和測(cè)序引物：

（1）對(duì)于IGS3靶序列：

上游引物：5’- AGAGGGTTATTTGAGTTTAGTTTTTT -3’，

下游引物：5’-biotin- AAAATTTACAAATTTCCAATCTACTATCC-3’，

測(cè)序引物：5’- TTTTTTTTTTAATTTTGTAATGAGT -3’；

（2）對(duì)于IGS4靶序列：

上游引物：5’- GTTTTTGGTAGGAAGAGGGAAAAAT -3’，

下游引物：5’-biotin- ATTAACCAAAATAATCTTAATCACCTAAC-3’，

測(cè)序引物：5’- AGGAAGAGGGAAAAATAATTA -3’；

（3）對(duì)于IGS5靶序列：

上游引物：5’- GTTTTTGATAGGGTTGGTTTGTATTG -3’，

下游引物：5’-biotin-CCACTAAAAAAAACAAAAACAACCTAATTA -3’，

測(cè)序引物：5’- GGTTGGTTTGTATTGG -3’；

（4）對(duì)于IGS6靶序列：

上游引物：5’- GTTGGGTTTATTTTTGTTATTGTTGG-3’，

下游引物：5’-biotin- ACTCTTCCAAAAAACCCCTAAT -3’，

測(cè)序引物：5’- ATTTTTGTTATTGTTGGAGA -3’；

所述下游引物標(biāo)有生物素。

2.一種鑒別同卵雙生子的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)DNA甲基化鑒別同卵雙生子的試劑、采用焦磷酸測(cè)序法鑒別同卵雙生子，包括如下步驟：

a）利用所述血液DNA提取試劑盒提取同卵雙生子DNA，得到DNA提取液；

b）利用所述DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒對(duì)步驟a）中所提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；

c）PCR擴(kuò)增

在PCR緩沖溶液、上下游引物和無(wú)核酶水混合溶液中加入步驟b）中經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

d）分別建立相應(yīng)的Assay，確定每條序列噴堿基的相應(yīng)順序

對(duì)于IGS3的序列噴堿基順序：

ATCGCTGATCGTGTGACTGATTCGTAGTTGATATATATGTGTGTAGTGTAGAGAATCGTG；

對(duì)于IGS4的序列噴堿基順序：

ATTGACTGATCGTGTGCTGATCGTGTGATCGTGTATTAGTATTGATGTCGAGTGTATATGATCGAG；

對(duì)于IGS5的序列噴堿基順序：

ATGCTGATCGCTAGTTATTAGTGTATGTCGTGAGTATCGAT；

對(duì)于IGS6的序列噴堿基順序：

ATATGTCAGTCGCTAGTTGGAGCTATTGATCGAGTGATAGTCGTATTGTGTAGTTCGTATGATCGAG；

e）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離和純化

步驟c）中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物加入含有結(jié)合緩沖液和磁珠的PCR板孔內(nèi)，恒溫水平震蕩處理后，用樣品吸附器吸附結(jié)合在磁珠上的含生物素的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)純化處理得到純凈的單鏈DNA模板；將所述單鏈DNA模板轉(zhuǎn)移至含測(cè)序引物的退火緩沖液中，恒溫退火，冷卻至室溫待測(cè)序；

f）對(duì)單鏈DNA模板進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)

準(zhǔn)備好焦磷酸測(cè)序反應(yīng)所用的酶混合物、底物混合物及dNTP，加入試劑艙，將步驟e)所得的單鏈DNA模板放入焦磷酸測(cè)序儀，根據(jù)步驟c）中的噴堿基順序進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)；

g）分析測(cè)序結(jié)果

焦磷酸測(cè)序儀自動(dòng)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行判讀并標(biāo)記出每個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化程度及平均甲基化水平，根據(jù)測(cè)序結(jié)果獲得的甲基化信息，對(duì)同卵雙生子進(jìn)行鑒別：以焦磷酸測(cè)序儀靈敏度A為標(biāo)準(zhǔn)，若同卵雙生子之間甲基化水平差值大于A，則認(rèn)為雙生子之間有差異；若同卵雙生子之間甲基化水平差值小于或等于A，則認(rèn)為雙生子之間無(wú)差異。