[發(fā)明專(zhuān)利]一種唾液樣本中痕量大麻的檢測(cè)方法及使用的SPR芯片

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710487526.0
• 申請(qǐng)日: 2017-06-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107238713A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范春雷;程向榮;陳喆;田男
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江諾迦生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/94
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/94;G01N33/543;G01N21/552;C07K16/44
• 代理公司: 杭州五洲普華專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)33260
• 代理人: 張瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種毒品大麻的檢測(cè)方法，尤其涉及一種唾液樣本中痕量大麻的檢測(cè)方法及其使用的SPR芯片，屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明中下列表達(dá)式的意義為：

THC：四氫大麻酚

KLH：血藍(lán)蛋白

OVA：雞卵白蛋白

背景技術(shù)

大麻，其主要有效化學(xué)成份為T(mén)HC，在吸食或口服后有精神和生理的活性作用，被認(rèn)為是世界三大毒品之一，社會(huì)危害性非常嚴(yán)重。

目前，針對(duì)大麻的檢驗(yàn)方法主要包括常規(guī)化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和氣相色譜/ 質(zhì)譜法、免疫檢測(cè)法和生物檢測(cè)法等。其中體內(nèi)檢材分析是當(dāng)下法庭科學(xué)研究的熱點(diǎn)，尿液是檢測(cè)分析濫用毒品應(yīng)用最為廣泛的體內(nèi)檢材。但是，現(xiàn)有的尿檢技術(shù)不能滿(mǎn)足犯罪現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，在此背景下，尋求一種可達(dá)到快速、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)的犯罪現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法成為了科學(xué)工作者研究重點(diǎn)。

表面等離子共振技術(shù)(SPR)是從20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，其應(yīng)用SPR原理檢測(cè)生物傳感芯片上配位體與分析物之間的相互作用情況，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，已經(jīng)成為生命科學(xué)和制藥領(lǐng)域的一種重要的研究工具。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有高靈敏度、響應(yīng)快、體積小、機(jī)械強(qiáng)度大、檢測(cè)過(guò)程快、實(shí)時(shí)檢測(cè)、能動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)生物分子相互作用的全過(guò)程和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)、無(wú)需標(biāo)記樣品、保持分子活性、對(duì)復(fù)合物的定量測(cè)定不干擾反應(yīng)的平衡等優(yōu)點(diǎn)，成為了檢測(cè)大麻的較優(yōu)選擇。目前，關(guān)于使用表面等離子共振技術(shù)快速檢測(cè)大麻的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(公開(kāi)號(hào)：CN102057277A)公開(kāi)了一種大麻使用的檢測(cè)，該專(zhuān)利采用的是基于結(jié)合伴侶的非競(jìng)爭(zhēng)性同源性免疫測(cè)定的時(shí)間分辯熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)分析；應(yīng)用基因工程方法制備能夠結(jié)合四氫大麻酚(THC)和抗-THC-抗體之間的免疫復(fù)合物的抗體片段。結(jié)合伴侶均須進(jìn)行熒光標(biāo)記，以便實(shí)現(xiàn)熒光計(jì)的 TR-FRET熒光檢測(cè)，檢測(cè)靈敏。另外，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(公開(kāi)號(hào)： CN101580544A)公開(kāi)了一種膠體金標(biāo)記大麻、四氫大麻酚單抗免疫檢測(cè)板，該專(zhuān)利描述了THC-KLH的制備；以THC-KLH為抗原，采用弗氏佐劑法(Freund’s adjuvant)免疫BALB/C小鼠；用單克隆抗體技術(shù)制備雜交瘤；用THC-KLH包被的酶聯(lián)板(ELISA 法)篩選出抗THC的雜交瘤細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提出了一種利用唾液樣本就可達(dá)到快速、準(zhǔn)確的痕量大麻的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的可通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種唾液樣本中痕量大麻的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法為利用SPR芯片在SPR儀上檢測(cè)待測(cè)樣本中的THC含量，所述SPR芯片為抗THC抗體SPR 芯片，所述抗THC抗體SPR芯片通過(guò)以下方法制得：

S1、將THC分別偶聯(lián)于KLH和OVA，得到THC-KLH和 THC-OVA；

S2、用上述THC-KLH和快速免疫佐劑免疫BALB/C小鼠，用THC-OVA檢測(cè)免疫小鼠抗THC的抗血清效價(jià)；

S3、取抗血清ELISA效價(jià)在6K以上的小鼠，取脾臟的B淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，經(jīng)單克隆篩選獲得抗血清 ELISA效價(jià)在10K以上的抗THC抗體雜交瘤細(xì)胞株；

S4、將上述雜交瘤細(xì)胞株接種至BALB/C小鼠腹腔，從腹水中制備純化抗體；

S5、用本瓜蛋白酶將上述純化抗體水解成Fc段和Fab段，將Fab段包被于3D環(huán)氧SPR芯片，獲得抗THC抗體SPR芯片。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測(cè)方法中，步驟S2 中所述的快速免疫佐劑為QuickAntibody-Mouse5W。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測(cè)方法中，步驟S2 中所述的THC-OVA檢測(cè)在THC-KLH和快速免疫佐劑免疫 BALB/C小鼠5周后進(jìn)行，進(jìn)一步優(yōu)選5-8周后進(jìn)行，以便獲得更高效的亞克隆細(xì)胞株。