[發(fā)明專利]一種用于快速檢測21種點突變β地中海貧血等位基因的芯片、擴增試劑及試劑盒

在審

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• 申請日: 2017-06-23
• 公開（公告）號: CN109112198A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳治中;卿吉琳
• 申請（專利權(quán)）人: 陳治中
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

本發(fā)明“一種用于快速檢測21種點突變β?地中海貧血等位基因的芯片、擴增試劑及試劑盒”，屬于分子診斷技術(shù)。基于直接多重PCR、Gap?PCR和反向點雜交相結(jié)合的檢測原理，根據(jù)各基因型的突變和/或缺失位點設(shè)計相應(yīng)的擴增引物和探針，以生物素標記引物，以氨基標記探針，并以基因芯片為基底，將探針固定在DNA芯片上，通過特異性引物擴增出來的PCR產(chǎn)物與探針進行雜交，以信號顯色盒判讀來進行地貧的診斷，同時設(shè)計質(zhì)控探針，更加保證結(jié)果質(zhì)量與準確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種β地中海貧血分子檢測技術(shù)，特別是涉及一種單管直接PCR(Direct PCR)檢測21種點突變β地中海貧血的試劑盒，屬于分子生物學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)

地中海貧血(thalassemia,簡稱地貧)，是是由于α或β珠蛋白基因缺失或突變導(dǎo)致珠蛋白鏈合成障礙，造成α鏈與β鏈的比例失去平衡，相對過剩的鏈呈游離狀態(tài)，進而導(dǎo)致血紅蛋白不穩(wěn)定，冗余的珠蛋白鏈沉積在紅細胞膜上，容易氧化變性，紅細胞膜的通透性和脆性發(fā)生改變，導(dǎo)致溶血性貧血，臨床上常表現(xiàn)出癥狀輕重不一的慢性進行性溶血性貧血。并且根據(jù)受累的珠蛋白肽鏈的類型分為α、β、γ、δ和δβ地貧等類型。其中以α、β地貧最為常見，危害也最大。廣泛發(fā)生于熱帶和亞熱帶國家，我國長江以南發(fā)病率高，無明顯癥狀的攜帶者超過人群20％。

β珠蛋白基因簇位于人體11號染色體的短臂上，總長度約為50Kb，包括ε、Gr、Ar、δ和β珠蛋白基因及2個假基因。β珠蛋白肽鏈是由β珠蛋白基因所編碼的146個氨基酸組成。β珠蛋白基因含2個內(nèi)含子及3個外顯子。β地中海貧血的主要分子病理學(xué)基礎(chǔ)是β珠蛋白基因的點突變及小的插入或缺失，包括β珠蛋白基因的啟動子序列突變或增強子突變都可引起β珠蛋白生成障礙性貧血。在其外顯子1、外顯子2、內(nèi)含子1及3’端調(diào)控區(qū)集中了中國人群中發(fā)現(xiàn)的大部分突變。目前全世界己報道約170種左右的β珠蛋白基因的突變類型，我國己發(fā)現(xiàn)至少有28種此類突變，最主要的有6種CD41-42，CD17，IVS-2nt654,TATAbox-28,CD71-72及CD26占中國人β地中海貧血突變基因總數(shù)的90％以上。

β地中海貧血是因調(diào)控β珠蛋白的基因缺陷而導(dǎo)致的β珠蛋白合成障礙的一種溶血性貧血。β地中海貧血是最常見的單基因遺傳病之一，在我國南方各省區(qū)高發(fā)，高發(fā)區(qū)人群基因攜帶率達到3-9％。β地中海貧血的純合子或或β⁰β⁺的雙重雜合子為致死性疾病，目前仍無較理想的治療手段，采用基因分析法進行產(chǎn)前診斷，可在妊娠早期對中、重型β地中海貧血患兒做出診斷并及時終止妊娠，以避免中、重型β地中海貧血患兒出生是目前預(yù)防本病行之有效的方法。

目前對β-地貧篩查方法如血常規(guī)參數(shù)檢測分析、紅細胞滲透脆性試驗、血紅蛋白電泳試驗等特異性不高，較易產(chǎn)生假陰性。對于α-地中海貧血的分子診斷,PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針雜交(PCR-ASO)是最早用于檢測點突變的一種方法，一次只能檢測一種突變，對于多個突變位點的檢測操作復(fù)雜，成本高而不適合常規(guī)檢測。近年發(fā)展起來的單鏈構(gòu)象多肽性分析(PCR-SSCP)、變性高效液相色譜分析(DHPLC)、TaqMan探針熒光PCR法與高分辨熔解曲線檢測技術(shù)(HRM)等，這些方法首先檢測費用昂貴，且操作要求費時或不定性。但這些方法檢測過程繁瑣、檢測所用時間長、使用試劑或者儀器昂貴和特殊的標記引物等，因而不利于臨床廣泛的推廣應(yīng)用。

并且這些技術(shù)均需DNA抽提的操作繁瑣復(fù)雜、耗時、易交叉污染、實驗需要DNA自動提取儀精密儀器和試劑耗材成本昂貴，在臨床上無法普遍推廣應(yīng)用。而DNA的質(zhì)量是PCR成功的一個非常關(guān)鍵的因素，并且提取與純化DNA過程極易污染，使得實驗易出現(xiàn)假陰性或者假陽性,極易造成漏檢或誤檢。

另外，同時這些技術(shù)所需樣本量多，對于邊遠地帶采集的標本運輸需要冷鏈設(shè)備，需三級包裝系統(tǒng)，標本儲存空間大；生物安全風險系數(shù)高。對全血、羊水和DBS直接檢測地貧的專利技術(shù)尚無，市場上尚無此類產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容