[發(fā)明專利]一種用于同時(shí)檢測(cè)NDV、IBV和H9N2亞型AIV的多重RPA引物和探針及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710484041.6
• 申請(qǐng)日: 2017-06-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107287349B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙軍;王川慶;楊霞;李永濤;常洪濤;陳陸;王新衛(wèi);劉紅英;姚慧霞;高冬生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 陳大通

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于同時(shí)檢測(cè)新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的多重RPA引物和探針，所述多重RPA引物和探針是由檢測(cè)新城疫病毒的引物和探針、檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒的引物和探針、檢測(cè)H9N2亞型禽流感病毒的引物和探針組成，本發(fā)明多重RPA引物和探針特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。本發(fā)明還公開(kāi)了一種多重RPA同時(shí)檢測(cè)新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的方法，該方法包括引物合成、模板RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、多重PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物分析等步驟，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，為有效檢測(cè)和鑒別常見(jiàn)禽呼吸道疾病的混合感染提供一種成本低、快速、特異的現(xiàn)場(chǎng)診斷方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于同時(shí)檢測(cè)新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)和H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)的多重RPA引物和探針及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

隨著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，禽類疫病的流行也發(fā)生了新的變化，多種疫病同時(shí)感染一種家禽的混合感染越來(lái)越普遍，給疫病的診斷和防控帶來(lái)很大困難。對(duì)復(fù)雜的疫病進(jìn)行快速的現(xiàn)場(chǎng)診斷，能夠?yàn)橐卟〉挠行Х揽貭?zhēng)取寶貴時(shí)間，最大限度地減少損失和疫病擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)以其能夠檢測(cè)痕量的病原DNA而一直被作為診斷多種疫病的金標(biāo)方法。但PCR需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備、低溫保存的試劑和避免交叉污染的技術(shù)操作要求，從而限制了PCR在現(xiàn)場(chǎng)診斷中的應(yīng)用。重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術(shù)是由英國(guó)公司TwistDx Inc開(kāi)發(fā)的一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶(Recombinase)、單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶(Polymerase)。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37℃-42℃左右。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于現(xiàn)場(chǎng)診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。RPA技術(shù)具有不同于常規(guī)PCR的諸多優(yōu)點(diǎn)：1)RPA反應(yīng)在常溫下即可進(jìn)行；2)RPA檢測(cè)的靈敏度很高；3)既可用于DNA，也可用于RNA的擴(kuò)增；4)可以進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增。

免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，英文縮寫為：GICT。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體金免疫層析法是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定有特定抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物和金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。