[發明專利]一種用于同時檢測NDV、IBV和H9N2亞型AIV的多重RPA引物和探針及其檢測方法

有效

• 申請號: 201710484041.6
• 申請日: 2017-06-23
• 公開（公告）號: CN107287349B
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 趙軍;王川慶;楊霞;李永濤;常洪濤;陳陸;王新衛;劉紅英;姚慧霞;高冬生
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 陳大通

1.一種用于同時檢測新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的多重RPA引物和探針組合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探針組合物是由用于檢測新城疫病毒的引物和探針、用于檢測傳染性支氣管炎病毒的引物和探針、用于檢測H9N2亞型禽流感病毒的引物和探針組成，其中，

所述用于檢測新城疫病毒的引物和探針的核苷酸序列為：

上游引物P1：5’-GCAGAGATCACTCACACTCACATCAGTATTTAGCAC-3’(SEQ ID NO.1)，

下游引物P2：5’-GCAGAGATCACTCACACTCACATCAGTATTTAGCAC-3’(SEQ ID NO.2)，

探針Probe1：

5’-488-CGGACATCTGCAACAGGGAGGGTATTCTTTT-THF-TACTCTGCGTTCCATC-Spacer C3-3’(SEQ ID NO.3)；

所述用于檢測傳染性支氣管炎病毒的引物和探針的核苷酸序列為：

上游引物P3：5’-CTTAACAAAACGGACTTAAATACCTACAGCTGGTCC-3’(SEQ ID NO.4)，

下游引物P4:5’-CTAGGTAGCCCAAGCAACGGATGTATAAAGTGAGACAC-3’(SEQ ID NO.5)，

探針Probe 2：5’-Fluorescein

amidite-CATAGGTGTTCCATTGCAGTGCACTTTAGTGCCCTG-THF-ATGGCACCTGGCCACCTGTCAGG-Spacer C3-3’(SEQ ID NO.6)；

所述用于檢測H9N2亞型禽流感病毒的引物和探針的核苷酸序列為：

上游引物P5：5’-CACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3’(SEQ ID NO.7)，

下游引物P6：5’-CATGCCTGATTAGTGGGTTGGTGGTAGTCGCCATCTG-3’(SEQ ID NO.8)，

探針Probe 3：

5’-Digoxigenin

-GTTGCACTCAGTTACTCAACTGGTGCGCTTGCCAGTTG-THF-ATGGGTCTCATATACAACCG-SpacerC3-3’(SEQ ID NO.9)。

2.根據權利要求1所述的多重RPA引物和探針組合物，其特征在于，所述用于檢測新城疫病毒的下游引物P2、用于檢測傳染性支氣管炎病毒的下游引物P4和用于檢測H9N2亞型禽流感病毒的下游引物P6的5’端均用biotin進行標記。

3.含有權利要求1或2所述多重RPA引物和探針組合物的試劑盒。

4.權利要求3所述的試劑盒在檢測新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒中的應用，所述的應用不以疾病的診斷和/或治療為目的。

5.一種多重RPA同時檢測新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)引物合成：合成權利要求1或2所述的多重RPA引物和探針組合物；

(2)RNA模板提取：分別提取新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的RNA；

(3)反轉錄：分別以提取的新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的RNA為模板，反轉錄成為cDNA；

(4)多重RPA擴增反應：以步驟(3)得到的新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的總cDNA為模板，采用權利要求1或2所述的多重RPA引物和探針組合物，在RPA反應管中進行多重RPA擴增反應；

(5)分析多重RPA擴增產物；

所述的方法不以疾病的診斷和/或治療為目的。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重RPA擴增反應體系以50μl計為：

其中，擴增反應體系中所有引物和探針的初始濃度均為20μM，且使用Twistnfo試劑盒提供的凍干酶復合物反應管作為反應管。