[發(fā)明專利]一種基于葡聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法和應(yīng)用

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• 申請日: 2017-06-23
• 公開（公告）號: CN107163132A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪少蕓;翁青霞;丁嵐;陳旭;蔡茜茜;王文龍;方衛(wèi)東
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K14/46;C07K1/107;C12N1/04;A01N1/02;A23L3/375
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊,林文弘

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及一種基于葡聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法和應(yīng)用，屬于生物、食品加工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

抗凍蛋白，俗稱冰結(jié)構(gòu)蛋白，又叫作熱滯蛋白，首先于1969年由 Devries 在南極海峽的一種極地魚（Trematomus borchgrevinki）的血液中發(fā)現(xiàn)。抗凍蛋白具有低溫保護活性，可以作為冷凍保護劑應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物及食品加工等領(lǐng)。如抗凍蛋白應(yīng)用于組織、細(xì)胞及微生物的低溫保存，可以顯著提高其冷凍存活率；抗凍蛋白能減少冷凍食品在低溫凍藏過程形成的冰晶及其重結(jié)晶對食品造成的品質(zhì)劣變，提高冷凍食品的穩(wěn)定性。

抗凍蛋白的抗凍活性主要來源于抗凍蛋白中的某些活性片段，并不是整個蛋白在起作用。汪少蕓等人通過酶解技術(shù)從牛皮、豬皮及魚皮等不同來源的膠原蛋白中酶解、分離出具有高抗凍活性的多肽片段。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)重結(jié)晶抑制活性對于抗凍蛋白發(fā)揮冷凍保護作用起到了至關(guān)重要的作用，然而抗凍蛋白的熱滯活性和冰結(jié)合特性對于當(dāng)凍藏溫度低于熱滯活性溫度區(qū)間的生物材料（如細(xì)胞、血液、組織）反而起到破壞甚至致死作用，主要因為當(dāng)凍藏溫度低于熱滯活性溫度范圍時，冰晶生長不受控制而快速轉(zhuǎn)變成針狀結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和解凍后細(xì)胞存活率的下降。這也是阻礙天然抗凍蛋白（或肽）作為冷凍保護劑進行實際應(yīng)用的主要因素。因此，近年來國際研究開始致力于開發(fā)一些具有重結(jié)晶抑制活性而沒有熱滯活性的新型抗凍蛋白，基于糖基化修飾的抗凍蛋白就是這類活性物質(zhì)的一種。例如一個由4個 Ser-Gly-Gly 三肽重復(fù)的肽鏈為骨架并通過 Ser 殘基的碳端連接一個半乳糖苷基形成的抗凍肽就發(fā)現(xiàn)具有很強的重結(jié)晶抑制活性而沒有熱滯活性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)糖基種類和肽鏈骨架中糖基化位置及氨基酸殘基類型對重結(jié)晶抑制活性有著顯著的影響作用，如半乳糖基修飾的抗凍肽重結(jié)晶抑制活性比甘露糖基修飾的抗凍肽強，而脯氨酸由于具有限制的旋轉(zhuǎn)角可使蛋白在溶液中具有明顯二級結(jié)構(gòu)，因此一些含脯氨酸的具有較強的重結(jié)晶抑制活性。

因此，本發(fā)明將不同來源的抗凍多肽與葡聚糖通過糖基化修飾手段，化學(xué)合成抗凍糖肽。所合成的抗凍糖肽的抗凍活性顯著高于原始抗凍多肽，可以廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存；并且該方法安全、易于控制，可以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的之一針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種基于葡聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法和應(yīng)用。添加本發(fā)明抗凍糖肽的細(xì)胞、組織、器官、微生物的冷凍存活率均顯著提高；將本發(fā)明應(yīng)用到冷凍保藏食品中，可以很好地保持冷凍食品原有品質(zhì)的穩(wěn)定性，顯著降低冷凍損傷引起的食品品質(zhì)劣變。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于葡聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法，按照如下方法制備：

按照抗凍多肽粉和葡聚糖之間質(zhì)量比為1:1 ~ 1:5的比例將抗凍多肽粉和葡聚糖混合，然后溶解于去離子水中，溶液最終濃度為5 ~ 15%（w/v），攪拌使其充分溶解；然后在60 ~ 80 ℃、pH為8.0 ~ 9.0條件下反應(yīng)1 ~ 2 h；反應(yīng)結(jié)束后，立即放在0 ℃水中冷卻以終止反應(yīng)，反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，得到所述的葡聚糖修飾的抗凍糖肽凍干粉。

所述的抗凍多肽粉的原料來源于豬皮、牛皮、魚皮或魚鱗。

所述的攪拌時間為10 ~ 20 min；所述冷卻時間為15~30 min。

如上所述的制備方法制得的抗凍糖肽的用途，所述的抗凍糖肽制備用于細(xì)胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案具有如下優(yōu)勢：

（1）本發(fā)明所用的抗凍多肽原料來源于食品源下腳料，具有安全無毒、來源廣泛，價格便宜等優(yōu)勢；

（2）本發(fā)明提供的抗凍糖肽合成方法高效、安全、成本低，易于控制；

（3）本發(fā)明合成的抗凍糖肽應(yīng)用廣泛，可應(yīng)用于細(xì)胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存；并且與抗凍多肽相比，其抗凍活性顯著提高。

具體實施措施

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不僅僅限于這些實施例。

實施例1

一種基于葡聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法，按照如下方法進行：

（1）按照抗凍多肽粉（來源于豬皮）和葡聚糖之間質(zhì)量比為1:2.7的比例將抗凍多肽粉和葡聚糖混合，然后溶解于去離子水中，溶液最終濃度為10%（w/v），攪拌15 min使其充分溶解；