[發(fā)明專利]基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測食源性致病菌的方法

在審

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• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107267610A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅云波;許文濤;徐瑗聰;黃昆侖;程楠;王蔚然;衛(wèi)昱君
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物傳感檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于核 酸層析生物傳感技術(shù)檢測食源性致病菌的方法。

背景技術(shù)

近年來，食源性致病菌引發(fā)的食品安全事件頻發(fā)，相應(yīng)的檢測技 術(shù)要求也逐漸嚴格。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)主要依賴于平板培養(yǎng)以及生理生 化鑒定，對于一些難以培養(yǎng)的菌株而言，容易產(chǎn)生檢測的假陰性。近 年來興起的快速檢測技術(shù)有酶聯(lián)免疫技術(shù)、PCR及定量PCR技術(shù)、等 溫擴增技術(shù)、傳感器技術(shù)等，綜合比較，傳感器技術(shù)在現(xiàn)場快速檢測 中因其高靈敏度和便攜性而占有更大的優(yōu)勢。

隨著技術(shù)的發(fā)展，各種各樣的傳感器都應(yīng)用于致病菌的檢測，例 如光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器、晶體傳感器等。大部分傳感器都具有 很好的檢測性能，但因為檢測成本的原因不能在現(xiàn)場進行推廣。相比 之下，核酸層析生物傳感器的優(yōu)勢就體現(xiàn)出來：成本低、易合成、穩(wěn) 定性好等，使之成為致病菌快速檢測領(lǐng)域的一股新流。

識別元件是核酸層析生物傳感器的一個重要部件。傳統(tǒng)的信號識 別通過抗原抗體之間的免疫親和實現(xiàn)，但是抗體的成本高且穩(wěn)定性 差，不適合推廣應(yīng)用。近年來核酸雜交逐漸應(yīng)用到信號識別中，體現(xiàn) 出良好的靈敏度和穩(wěn)定性。肽核酸是一種人工核酸，能夠與核酸之間 發(fā)生堿基配對，且穩(wěn)定性更高，因此，將肽核酸應(yīng)用在核酸傳感器的 識別元件中，將會顯著提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。

為了提高檢測的靈敏度，信號的放大至關(guān)重要，通過分子擴增技 術(shù)能夠有效實現(xiàn)原始信號的放大。一般用到的預(yù)擴增技術(shù)有PCR技 術(shù)、LAMP技術(shù)、RPA技術(shù)等，考慮到現(xiàn)場檢測的時效性，RPA技術(shù) 最能滿足檢測需求。RPA技術(shù)是一種重組聚合酶擴增技術(shù)，能夠在短 時間內(nèi)實現(xiàn)產(chǎn)物的累積，但是產(chǎn)物是雙鏈核酸，無法用單鏈核酸試紙 條進行可視化檢測。為了提高RPA技術(shù)的實用性，將通用接頭及核酸 阻斷技術(shù)引入到RPA技術(shù)中，建立一種新型的通用接頭阻斷重組聚合 酶擴增技術(shù)，能夠得到帶有單鏈接頭的擴增產(chǎn)物，利用單鏈試紙條實 現(xiàn)可視化檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測食源 性致病菌的方法。

本發(fā)明構(gòu)思如下：通過建立一種功能核酸全程控制的便攜、簡單、 封閉式的生物傳感器，用于實現(xiàn)食源性致病菌的現(xiàn)場快超靈敏檢測。 將通用接頭阻斷技術(shù)應(yīng)用在RPA技術(shù)中實現(xiàn)雙鏈產(chǎn)物向單鏈產(chǎn)物的 轉(zhuǎn)化，同時也能推廣應(yīng)用到其他的雙鏈分子擴增技術(shù)中，拓展了分子 擴增技術(shù)的應(yīng)用范圍。本發(fā)明構(gòu)建的基于肽核酸的單鏈核酸層析試紙 條，能夠高效捕獲單鏈核酸，提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性，實現(xiàn)可視化 檢測。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于構(gòu)建RPA生物傳 感器的通用阻斷接頭序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供一種基于肽核酸的核酸層析試紙條，所述試紙條的 制備方法包括以下步驟：

1)納米金顆粒的制備；

2)肽核酸探針的制備：人工合成質(zhì)控捕獲探針CCP、檢測捕獲 探針TCP和連接探針P，它們的序列分別為：

質(zhì)控捕獲探針CCP：5’-biotin-TGGTGGTGCTGGTT-3’

檢測捕獲探針TCP：5’-biotin-AACCAGCACCACCA-3’

連接探針P：5’-Cys-AACCAGCACCACCA-Glu-Glu-Glu-3’

3)納米金修飾的連接探針P的制備；

4)基于肽核酸的核酸層析試紙條的組裝：所述試紙條包括樣品 墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，所述硝酸纖維素膜上設(shè) 有至少1條檢測線和1條質(zhì)控線；

①將樣品墊和結(jié)合墊浸泡在緩沖液中，然后37℃烘干2-3h；所述 緩沖液為：0.25-0.5％Triton X-100，0.1-0.2M硼酸鹽緩沖液，0.15 -0.3M NaCl，pH 8.0；其中，所述結(jié)合墊上固定有納米金修飾的連接 探針P；

②將30-50μL的1mg/ml鏈霉親和素溶液與30-50μL的100μM肽 核酸捕獲探針溶液進行混合，然后在室溫下孵育1-2h，分別制備出鏈 霉親和素-生物素化的質(zhì)控捕獲探針和檢測捕獲探針，然后分別在硝 酸纖維素膜上劃出質(zhì)控線和檢測線，37℃烘干12-14h；

③將上述樣品墊、結(jié)合墊、帶有質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜 以及吸收墊依次粘貼在底板上，完成試紙條的組裝。

步驟1)中利用檸檬酸鈉燒金法制備粒徑為13nm的納米金顆粒。