[發明專利]基于核酸層析生物傳感技術檢測食源性致病菌的方法

在審

• 申請號: 201710482892.7
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107267610A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 羅云波;許文濤;徐瑗聰;黃昆侖;程楠;王蔚然;衛昱君
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

1.一種基于肽核酸的核酸層析試紙條，其特征在于，所述試紙條的制備方法包括以下步驟：

1)納米金顆粒的制備；

2)肽核酸探針的制備：人工合成質控捕獲探針CCP、檢測捕獲探針TCP和連接探針P，它們的序列分別為：

質控捕獲探針CCP：5’-biotin-TGGTGGTGCTGGTT-3’

檢測捕獲探針TCP：5’-biotin-AACCAGCACCACCA-3’

連接探針P：5’-Cys-AACCAGCACCACCA-Glu-Glu-Glu-3’

3)納米金修飾的連接探針P的制備；

4)基于肽核酸的核酸層析試紙條的組裝：所述試紙條包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，所述硝酸纖維素膜上設有至少1條檢測線和1條質控線；

①將樣品墊和結合墊浸泡在緩沖液中，然后37℃烘干2-3h；所述緩沖液為：0.25-0.5％Triton X-100，0.1-0.2M硼酸鹽緩沖液，0.15-0.3M NaCl，pH 8.0；其中，所述結合墊上固定有納米金修飾的連接探針P；

②將30-50μL的1mg/ml鏈霉親和素溶液與30-50μL的100μM肽核酸捕獲探針溶液進行混合，然后在室溫下孵育1-2h，分別制備出鏈霉親和素-生物素化的質控捕獲探針和檢測捕獲探針，然后分別在硝酸纖維素膜上劃出質控線和檢測線，37℃烘干12-14h；

③將上述樣品墊、結合墊、帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜以及吸收墊依次粘貼在底板上，完成試紙條的組裝。

2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于，步驟1)中利用檸檬酸鈉燒金法制備粒徑為13nm的納米金顆粒。

3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于，步驟3)具體為：將5-10μM步驟2)的連接探針P與10-20nM步驟1)的納米金顆粒在5mM磷酸緩沖液中反應12-14h，然后14000rpm離心20-30分鐘，收集沉淀物，再用5mM磷酸緩沖液沖洗沉淀物，最后溶解在10mM的磷酸緩沖液中，即得納米金修飾的連接探針P。

4.根據權利要求1-3任一項所述的試紙條，其特征在于，步驟3)具體為：將5μM步驟2)的連接探針P與10nM步驟1)的納米金顆粒在5mM磷酸緩沖液中反應12h，然后14000rpm離心20分鐘，收集沉淀物，再用5mM磷酸緩沖液沖洗沉淀物，最后溶解在10mM的磷酸緩沖液中，即得納米金修飾的連接探針P；

步驟4)基于肽核酸的核酸層析試紙條的組裝：

①將樣品墊和結合墊浸泡在緩沖液中，然后37℃烘干2-3h；所述緩沖液為：0.25％Triton X-100，0.1M硼酸鹽緩沖液，0.15M NaCl，pH 8.0；

②將30μL的1mg/ml鏈霉親和素溶液與30μL的100μM肽核酸捕獲探針溶液進行混合，然后在室溫下孵育1h，分別制備出鏈霉親和素-生物素化的質控捕獲探針和檢測捕獲探針，然后分別在硝酸纖維素膜上劃出質控線和檢測線，37℃烘干12h；

③將上述樣品墊、結合墊、帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜以及吸收墊依次粘貼在底板上，完成試紙條的組裝。

5.基于核酸層析生物傳感技術檢測食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、以目標致病菌的高特異性毒力基因為靶序列，設計RPA引物RPA-UF和RPA-UR；

S2、提取待測樣品DNA，以DNA為模板，利用步驟S1的RPA引物RPA-UF和RPA-UR進行RPA擴增反應；

S3、將步驟S2的RPA擴增產物與分析緩沖液混合，滴加到權利要求1-4任一項所述試紙條的樣品墊上，反應5-8min，判讀結果:陰性反應：質控線顯色，檢測線不顯色；陽性反應：質控線、檢測線均顯色；失效反應：若質控線不顯色，則檢測失敗或試紙條失效；

其中，步驟S1具體為：以目標致病菌的高特異性毒力基因為靶序列，設計RPA擴增引物RPA-F、RPA-R，將通用阻斷接頭和至少1個C3阻斷子順次連接到引物RPA-F、RPA-R的5’端，得到用于通用接頭阻斷RPA擴增技術的引物RPA-UF、RPA-UR；其中，所述通用阻斷接頭的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

步驟S3所述分析緩沖液為：4×SSC，2％BSA，0.05％Tween-20，pH 7.0。