[發(fā)明專利]基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710482408.0
• 申請(qǐng)日: 2017-06-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107419007A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅云波;許文濤;徐瑗聰;張莉;黃昆侖;程楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

1.用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的LAMP引物組，其特征在于，包括：

外側(cè)正向引物F3：5’-GTCAAAGAACTGATAAATATGGAC-3’；

外側(cè)反向引物B3：5’-TTACAATGAGCATTATTGACCT-3’；

內(nèi)側(cè)正向引物FIP：5’-GCCTTGACGAACTAAAGCTTCGGTGGCTTAGCGTATATTTATGC-3’；

內(nèi)側(cè)反向引物BIP：5’-TTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGC-GAATCAGCGTTGTCTTCG-3’；

其中，引物FIP的5’端標(biāo)記生物素，引物BIP的5’端標(biāo)記熒光素FITC。

2.一種納米酶核酸層析試紙條，其特征在于，所述試紙條的制備方法包括以下步驟：

1)Fe₃O₄磁顆粒的制備；

2)納米酶探針的制備：將Fe₃O₄磁顆粒與生物素二抗進(jìn)行孵育，得到生物素二抗納米酶探針；

3)納米酶核酸層析試紙條的組裝：所述試紙條包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有至少1條檢測(cè)線和1條質(zhì)控線；所述結(jié)合墊上固定有生物素二抗納米酶探針；

①分別用FITC抗體和生物素抗體在硝酸纖維素膜上劃出檢測(cè)線和質(zhì)控線，烘干；

②將上述樣品墊、結(jié)合墊、帶有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜以及吸收墊依次粘貼在底板上，完成試紙條的組裝。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試紙條，其特征在于，步驟1)中利用水熱法合成Fe₃O₄磁顆粒，具體為：將0.6-0.8g FeCl₃·6H₂O溶解在20mL乙二醇中，然后加入1.5-2.0g醋酸鈉，攪拌30-40min，然后密封在高壓釜中，200℃加熱16-18h；磁顆粒產(chǎn)物用乙醇洗滌，并在60℃下干燥；將二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺各5-8mg通過(guò)渦旋溶解在1mL去離子水中，制得混合液，然后將5-8mg磁顆粒加入混合液中，室溫下孵育30-40min，然后用磁鐵收集磁顆粒，用超純水洗滌，即得Fe₃O₄磁顆粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試紙條，其特征在于，步驟2)具體為：將濃度100μg/mL的生物素二抗加入50mM pH 6.0的醋酸鈉緩沖液中，然后與5-8mg的Fe₃O₄磁顆粒混合，將混合物渦旋混合，4℃孵育過(guò)夜；用pH7.0的PBS液洗滌混合物，然后在50mM pH7.2的Tris緩沖液中室溫孵育30-40min；再用pH7.0的PBS液洗滌，即得到生物素二抗納米酶探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試紙條，其特征在于，步驟2)和3)中所述的生物素二抗為羊抗鼠IgG；步驟3)中所述硝酸纖維素膜為Millipore135S。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于，步驟3)中檢測(cè)線設(shè)在距硝酸纖維素膜下邊緣1.1cm的位置上，質(zhì)控線設(shè)在距硝酸纖維素膜下邊緣1.6cm的位置上；檢測(cè)線與質(zhì)控線之間的距離為4.5mm，按1.0μL/cm將FITC抗體和生物素抗體分別噴涂在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，其中檢測(cè)線和質(zhì)控線上包被的抗體濃度均為0.5-2mg/mL。