[發明專利]基于核酸層析生物傳感技術檢測金黃色葡萄球菌的方法

在審

• 申請號: 201710482408.0
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107419007A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 羅云波;許文濤;徐瑗聰;張莉;黃昆侖;程楠
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

技術領域

本發明涉及生物傳感檢測技術領域，具體地說，涉及一種基于核酸層析生物傳感技術檢測金黃色葡萄球菌的方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，有“嗜肉菌”的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染。典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀,無芽胞、鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色陽性。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素已成為世界性衛生難題，在美國，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33％，加拿大則更多，占到45％，中國金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時有發生。

傳統的細菌檢測方法主要根據生理生化特征，但是傳統的檢測方法需要經過前增菌、選擇性平板分離、生物化學鑒定等步驟，從取樣到確定結果需要5-7天，檢測周期長，操作繁瑣，工作量大；利用抗原抗體反應的特異性，對細菌進行鑒別，已有半個多世紀的歷史，但是微生物抗體的篩選十分繁瑣，并且最終的檢測特異性不高；分子生物學檢測技術的不斷完善和發展，克服了傳統檢測方法實驗操作繁瑣、耗時長等問題，也使得針對微生物開展的快速檢測方法得到迅速發展，但是分子生物學方法的缺點在于不容易分析結果。隨著現代生物技術的發展，比傳統方法更快捷、更靈敏的生物傳感器新技術在食品安全檢測領域嶄露頭角。生物傳感器具備特異性強、靈敏度高等優點，可以簡化分析檢測步驟，縮短分析時間，更重要的是使在線實時檢測成為可能，便于攜帶和野外作業，在食品安全領域得到了較快的發展。近年來，眾多新材料、新技術的開發和應用正成為研究的熱點，為生物傳感器的發展注入了新的活力，在微生物檢測領域顯示出巨大的應用潛力。因此建立金黃色葡萄球菌可靠的、快速的傳感器檢測方法，特別是能夠鑒定死活菌的方法，在日常監控、市場篩查等方面具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于核酸層析生物傳感技術檢測金黃色葡萄球菌的方法。

本發明構思如下：開發一種金黃色葡萄球菌的快速和超靈敏檢測方法，特別是能夠鑒定死活菌的方法，建立基于疊氮碘化丙啶(PMA)，環介導等溫擴增反應(LAMP)和納米酶試紙的活菌檢測的連續級聯納米酶生物傳感器。在LAMP反應中，使用熒光素(FITC)修飾的和生物素(BIO)修飾的引物測定金黃色葡萄球菌的nuc基因。將PMA與LAMP組合，應用于死活金黃色葡萄球菌的分離。然后，使用納米酶探針制備基于磁性顆粒的免疫層析條(納米酶條)用于檢測擴增信號，通過目視檢測或利用條形讀出器進行結果判讀或定量，為現場檢測金黃色葡萄球菌活菌提供快速、超靈敏和便捷的工具。

為了實現本發明目的，本發明首先提供用于檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的LAMP引物組，包括(SEQ ID NO:1-4)：

外側正向引物F3：5’-GTCAAAGAACTGATAAATATGGAC-3’；

外側反向引物B3：5’-TTACAATGAGCATTATTGACCT-3’；

內側正向引物FIP：5’-GCCTTGACGAACTAAAGCTTCGGTGGCTTAGCGTATATTTATGC-3’；

內側反向引物BIP：5’-TTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGC-GAATCAGCGTTGTCTTCG-3’。

其中，引物FIP的5’端標記生物素，引物BIP的5’端標記熒光素FITC。

本發明還提供一種納米酶核酸層析試紙條，所述試紙條的制備方法包括以下步驟：

1)Fe₃O₄磁顆粒的制備；

2)納米酶探針(MNP)的制備：將Fe₃O₄磁顆粒與生物素二抗進行孵育，得到生物素二抗納米酶探針；

3)納米酶核酸層析試紙條的組裝：所述試紙條包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，所述硝酸纖維素膜上設有至少1條檢測線和1條質控線；所述結合墊上固定有生物素二抗納米酶探針；

①分別用FITC抗體和生物素抗體在硝酸纖維素膜上劃出檢測線和質控線，烘干；