[發(fā)明專利]一種抑制力學(xué)感知蛋白PDLIM3降解的純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710480803.5
• 申請(qǐng)日: 2017-06-22
• 公開（公告）號(hào): CN107267580A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯海;石苗;周伯儒;尹大川
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C07K14/47;C07K1/34
• 代理公司: 西北工業(yè)大學(xué)專利中心61204
• 代理人: 顧潮琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化、結(jié)晶領(lǐng)域，涉及一種抑制力學(xué)感知蛋白PDLIM3在純化過(guò)程中降解的方法。

背景技術(shù)

PDLIM3蛋白主要在心肌和骨骼肌中表達(dá)，可以和α輔肌動(dòng)蛋白結(jié)合，增強(qiáng)α輔肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白纖維的交聯(lián)。PDLIM3蛋白在肌肉力學(xué)感知及信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。PDLIM3蛋白的突變將會(huì)引起肌肉萎縮癥、心肌癥、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良等與肌肉相關(guān)的疾病。

通常，蛋白質(zhì)分子是不穩(wěn)定的，易受外部環(huán)境因素影響，在純化濃縮過(guò)程中易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解或變形，用于后續(xù)結(jié)晶的高濃度蛋白極難獲得。文獻(xiàn)1：“Purification,characterization,and crystallization of membrane bound Escherichia coli,tyrosine kinase[J].Protein Expression&Purification,2016,125:34-42.”報(bào)道在制備和純化過(guò)程中，蛋白質(zhì)很容易出現(xiàn)降解、凝聚的傾向，導(dǎo)致獲得的樣品濃度降低、活性較差，在后續(xù)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中很難獲得蛋白質(zhì)晶體。文獻(xiàn)2：“Toward the Crystallization of Photosystem II Core Complex from Pisum sativum L.[J].Crystal Growth&Design,2010,10(8):3391-3396.”報(bào)道來(lái)自豌豆的光合系統(tǒng)II核心復(fù)合物容易被氧化，使活性蛋白質(zhì)純度降低，進(jìn)而無(wú)法得到蛋白質(zhì)晶體。文獻(xiàn)3：“Purification and Characterization of a Novel Cold Shock Protein-Like Bacteriocin Synthesized by Bacillus thuringiensis[J].Sci Rep,2017,6:35560.”報(bào)道蘇云金桿菌合成的冷休克蛋白質(zhì)無(wú)法承受高溫，在高溫下會(huì)部分發(fā)生降解，也難以得到蛋白質(zhì)晶體。

對(duì)于蛋白質(zhì)的純化，為獲得高濃度蛋白質(zhì)溶液，即使是較大分子量的蛋白質(zhì)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍會(huì)采用小截流孔徑的濃縮管來(lái)濃縮蛋白質(zhì)。文獻(xiàn)4：“Ultrafiltration behavior of an Fc-fusion protein:Filtrate flux data and modeling[J].Journal of Membrane Science,2017,528:171-177.”報(bào)道采用10kDa孔徑的超濾膜來(lái)超濾94kDa的目標(biāo)蛋白，仍取得較高純度的樣品。文獻(xiàn)5：“Food-grade single-cell protein production,characterization and ultrafiltration recovery of residual fermented whey proteins from whey[J].Food&Bioproducts Processing,2016,99:156-165.”報(bào)道在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中，對(duì)于涉及的蛋白質(zhì)分子即使是選擇比蛋白質(zhì)分子量小很多倍的盡可能小孔徑的濃縮管，也會(huì)達(dá)到很好的濃縮效果，獲得的蛋白質(zhì)具有很好的活性。因而行業(yè)內(nèi)默認(rèn)選擇10kDa孔徑的超濾膜來(lái)濃縮分子量大于10kDa目標(biāo)蛋白樣品。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在濃縮過(guò)程中出現(xiàn)降解，常添加酶抑制劑等抑制蛋白質(zhì)降解，很少會(huì)從蛋白質(zhì)性質(zhì)入手解決降解問(wèn)題。由于力學(xué)感知蛋白PDLIM3具有力學(xué)感知功能，因此對(duì)受力比較敏感，用10kDa的超濾膜獲得的樣品，在純化濃縮過(guò)程中常用的10kDa的超濾膜，由于截留小孔徑，導(dǎo)致蛋白PDLIM3長(zhǎng)時(shí)間受力作用，降解嚴(yán)重，活性很低，純度很低，顯然這種常規(guī)的選擇方法并不能適用于力學(xué)感知蛋白PDLIM3的純化方法。由于X射線衍射技術(shù)需要蛋白質(zhì)晶體來(lái)獲取蛋白質(zhì)衍射圖譜，高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體需要在高純度蛋白質(zhì)溶液中生長(zhǎng)。所以，獲得高質(zhì)量、高純度、高活性的力學(xué)感知蛋白PDLIM3濃縮液具有極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種抑制力學(xué)感知蛋白PDLIM3降解的純化方法，在純化后的濃縮過(guò)程中，盡可能減少力學(xué)感知蛋白PDLIM3受力的大小和受力的時(shí)間，改善其力學(xué)環(huán)境，最終達(dá)到顯著抑制力學(xué)感知蛋白PDLIM3降解的目的。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟：