[發(fā)明專利]一種抑制力學(xué)感知蛋白PDLIM3降解的純化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710480803.5
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107267580A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯海;石苗;周伯儒;尹大川
• 申請（專利權(quán)）人: 西北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/47;C07K1/34
• 代理公司: 西北工業(yè)大學(xué)專利中心61204
• 代理人: 顧潮琪

1.一種抑制力學(xué)感知蛋白PDLIM3降解的純化方法，其特征在于包括下述步驟：

第一步，表達(dá)力學(xué)感知蛋白PDLIM3，將表達(dá)菌株接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.4～0.8時(shí)，加入摩爾濃度為1M IPTG的母液至IPTG的終摩爾濃度為0.2～0.8mM，繼續(xù)培養(yǎng)3～8h；在0～4℃溫度下，1000～4000rpm離心菌液10～30min，棄掉上清液，收集菌體；

第二步，配置摩爾濃度為50mM Tris-HCl、50mM NaCl、pH8.0的裂解液，用裂解液重懸菌體，菌體與裂解液的質(zhì)量比為1:5～20；然后加入EDTA終摩爾濃度0.5～1.5mM、PMSF終摩爾濃度0.3～0.7mM、β-巰基乙醇終摩爾濃度5～15mM、lysozyme終濃度0.5-1.5mg/mL和甘油終體積濃度3～7％；將溶液混合均勻后，在0～4℃溫度下超聲破碎細(xì)胞0.5～1.5小時(shí)，最后在0～4℃下，10000～15000rpm離心10～60min，收集上清液；

第三步，用孔徑0.22μm的濾膜過濾上清液，然后向?yàn)V出物中加入EDTA終摩爾濃度0.5～1.5mM、PMSF終摩爾濃度0.3～0.7mM、β-巰基乙醇終摩爾濃度5～15mM、甘油終體積濃度3～7％和咪唑終摩爾濃度5～15mM；混合均勻后，加入Ni Sepharose^TM6 Fast Flow填料，濾出物與Ni Sepharose^TM6 Fast Flow填料體積比為50～200：1，在0-4℃下旋轉(zhuǎn)混勻1-6h，使目的蛋白與填料充分結(jié)合；采用重力流色譜柱和摩爾濃度為80-500mM的咪唑溶液對目的蛋白進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；

第四步，使用截留分子量25-30kDa超濾膜的超濾管過濾洗脫液，濃縮目的蛋白。