[發明專利]一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝

有效

• 申請號: 201710479162.1
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107177649B
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發明（設計）人: 張艷;任東升;劉希望
• 申請（專利權）人: 西藏諾迪康藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 成都坤倫厚樸專利代理事務所(普通合伙) 51247
• 代理人: 劉坤

本發明公開了一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝，包括以下步驟：在發酵罐中，加入BHD培養基18～20L和甘油65～80mL，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/L，接種，調節通氣量使發酵液中的溶氧量為30％～50％，調節pH值為6.8～7.2，培養溫度為37℃；當OD₆₀₀為10～15時，加入異丙基硫代半乳糖苷至其終濃度為0.5～1.0mmol/L誘導，并向發酵罐內流加150～300mL/h的補料液A，3～6h后停止發酵培養，收獲細菌，即可。本發明發酵工藝，顯著提高了rhBNP融合蛋白的表達水平，其表達量高達34.5％～38.3％，具有良好的商業開發價值并取得了商業上的極大成功。

技術領域

本發明屬于生物發酵領域，具體涉及一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝。

背景技術

心力衰竭是一個重大的公共衛生難題，研究顯示：中國35歲以上人群中患病率高達2％，患者約1000萬人，并且每年新增患者50萬例，嚴重威脅我國人民的生命健康安全，隨著人口老齡化，我國的心力衰竭患者數量還將進一步上升。

重組人腦利鈉肽(rhBNP，商品名：新活素)，能夠有效治療心力衰竭等病癥，快速緩解患者呼吸困難、利尿排鈉、拮抗神經內分泌、抗心臟重塑，對心臟起到全面保護作用，已被《中國心力衰竭診斷和治療指南(2014年版)》載入并推薦使用。

現階段，重組人腦利鈉肽主要是通過基因重組技術制備得到，它利用rhBNP基因工程菌發酵培養，然后，分離純化，制劑，最終得到重組人腦利鈉肽產品；其中，發酵工藝是決定重組人腦利鈉肽產量的關鍵步驟之一，它直接影響到融合蛋白表達量的高低，如果蛋白表達量過低，將會導致單位產品的生產成本大幅度增加，從而被認為不具有商業開發價值，進而也就無法實現產業化生產。

因此，為了能夠實現重組人腦利鈉肽的產業化生產，降低單位產品的生產成本，首要任務就是開發一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝。

本發明提供的一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝，它包括以下步驟：

在發酵罐中，加入BHD培養基18L～20L和甘油65mL～80mL，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/L，接種重組人腦利鈉肽基因工程菌300mL～500mL，調節通氣量使發酵液中的溶氧量為30％～50％，調節pH值為6.8～7.2，培養溫度為37℃；當OD₆₀₀為10～15時，加入異丙基硫代半乳糖苷至其終濃度為0.5mmol/L～1.0mmol/L誘導，并向發酵罐內流加150mL/h～300mL/h的補料液A，3h～6h后停止發酵培養，收獲細菌，即可；

其中，

所述BHD培養基的配方為：每升BHD培養基中，含有胰蛋白胨4g～6g、酵母粉8g～12g、磷酸二氫鉀2g～5g、磷酸氫二鉀10g～15g、硫酸鎂0.4g～1g、氯化鈉0.4g～1g、維生素10mg～15mg和微量金屬元素20mg～30mg，溶劑為水；

所述補料液A的配方為：每升補料液A中，含有胰蛋白胨150g～200g、酵母粉60g～100g和甘油160mL～220mL，溶劑為水。

進一步的，加入BHD培養基18.5L和甘油74mL；或者，加入BHD培養基20L和甘油68mL。

進一步的，接種重組人腦利鈉肽基因工程菌400mL，調節通氣量使發酵液中的溶氧量為30％～50％，調節pH值為7.0。

進一步的，當OD₆₀₀為12時，加入異丙基硫代半乳糖苷至其終濃度為0.5mmol/L～1.0mmol/L誘導，并向發酵罐內流加200mL/h的補料液A，4h后停止發酵培養。