[發(fā)明專利]用于大豆體細胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的培養(yǎng)方法

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• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN107182786A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發(fā)明（設計）人: 楊向東;楊靜;趙倩倩;邢國杰;牛陸;郭東全;賀紅利;錢雪燕;姚瑤
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N5/04
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技術(shù)領域

本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領域，尤其涉及一種用于大豆體細胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

大豆是世界上最重要的油料作物和高蛋白糧食作物之一，也是人類植物性蛋白和油脂的重要來源。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應用為大豆功能基因組學的研究及新品種培育提供了有效手段。作為推廣時間最早、推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，僅2014年，全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積就達9000萬公頃，占大豆總種植面積的82％，占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的49％。轉(zhuǎn)基因大豆已成為世界大豆主產(chǎn)國大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要動力。

組織培養(yǎng)作為轉(zhuǎn)基因大豆研究和育種基礎和前提，外植體細胞能否再生及再生頻率的高低在很大程度上決定了大豆轉(zhuǎn)化效率，并在一定程度上影響轉(zhuǎn)基因大豆育種效率。目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中外植體細胞再生方式主要有2種，即不定芽器官發(fā)生(Organogenesis)和體細胞胚發(fā)生(Somatic embryogenesis)。大豆子葉節(jié)、莖尖、下胚軸、初生葉、花序等均可以通過不定芽器官發(fā)生方式再生(Hinchee MAW，1988；Paz MM，2006；Olhoft PM，2001；Liu HK，2004；Ko TS，2003；Zhong H，2009)；而由大豆未成熟子葉誘導產(chǎn)生的體細胞胚狀體主要通過胚胎發(fā)生的方式再生。與不定芽器官發(fā)生方式相比，體細胞胚狀體發(fā)生方式的一個主要優(yōu)勢是體細胞胚體為單細胞起源，可以有效避免嵌合體的產(chǎn)生。因此，體細胞胚胎發(fā)生方式也被認為是解決大豆遺傳轉(zhuǎn)化中嵌合體問題的最有潛力的再生體系。另外，體細胞胚胎發(fā)生方式的一個重要特點是可以模擬大豆合子胚發(fā)育過程，因而對于研究大豆胚體發(fā)育、種子形成等重要生理過程具有其獨特的意義。

1991年Finer等首次利用基因槍法轉(zhuǎn)化大豆懸浮體細胞團并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。Stewart等(1996)利用該方法將抗蟲基因cry1Ac導入大豆并獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆植株。同年，Hadi等(1996)利用基因槍法將12個基因同時導入大豆體細胞團，并獲得了轉(zhuǎn)基因大豆植株。在此基礎上，Santarem等(1999)，Ponappa等(1999)和Khalafalla等(2005)進一步研究了影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素，并對基因槍轉(zhuǎn)化法進行優(yōu)化。由于利用體細胞胚狀體進行遺傳轉(zhuǎn)化時不存在與微生物之間的互作，其轉(zhuǎn)化效率主要與胚狀體狀態(tài)、轟擊參數(shù)以及轉(zhuǎn)化細胞再生率有關(guān)。如Hazel等(1998)發(fā)現(xiàn)短時間培養(yǎng)(＜6個月)的大豆懸浮體細胞團轉(zhuǎn)化效率極低，而培養(yǎng)6個月后的轉(zhuǎn)化效率則明顯提高。王曉春等(2005)發(fā)現(xiàn)利用基因槍轟擊球形期體細胞團時，其轉(zhuǎn)化效率(8.0％)要顯著高于發(fā)育晚期的體細胞胚(0％)。Finer等(1988)、Parrott等(1989)、Bailey等(1993)采用大豆體細胞胚狀體懸浮培養(yǎng)方法開展轉(zhuǎn)基因研究獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。由于新生胚主要分布在舊胚表面，在進行液體培養(yǎng)篩選時轉(zhuǎn)化胚體可以和篩選劑充分接觸，因而有效提高了篩選效果。其缺點是體細胞團組織培養(yǎng)過程復雜，培養(yǎng)周期較長，易產(chǎn)生體細胞突變及再生苗不結(jié)實等情況。利用大豆未成熟子葉開展轉(zhuǎn)基因研究的一個主要問題是外植體取樣時間受季節(jié)和環(huán)境的影響。外植體取樣時間及發(fā)育狀態(tài)通常會嚴重影響誘導胚狀體發(fā)生頻率和再生頻率。另外，在自然條件下，外植體取樣周期也受季節(jié)的嚴重限制。因此，如何實現(xiàn)大豆胚狀體的持續(xù)增殖與保存，為大豆遺傳轉(zhuǎn)化提供持續(xù)提供高分生能力且同步化的體細胞胚狀體，對于開展大豆轉(zhuǎn)基因研究和育種具有重要的意義。基于這一理解，本發(fā)明利用大豆未成熟子葉誘導產(chǎn)生的體細胞胚狀體，在增殖培養(yǎng)基和特定培養(yǎng)條件下實現(xiàn)其持續(xù)增殖和繼代保存。在此基礎上，提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種大豆體細胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的培養(yǎng)方法。利用該改良培養(yǎng)方法可以保持大豆體細胞胚狀體持續(xù)增殖3年以上仍具有極強的再生能力，可以為大豆遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因研究持續(xù)提供高分生能力的外植體材料

采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：：

一種用于大豆體細胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)取開花后15-20天的大豆未成熟子葉接種于誘導培養(yǎng)基，于黑暗條件下培養(yǎng)6-8周后，在外植體周圍誘導產(chǎn)生成簇、黃綠色的球形體細胞胚狀體；

(2)將球形胚狀體轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為400-1000Lux低光照強度，光周期為16小時光/8小時暗交替，培養(yǎng)溫度25±1℃，每2-3周換一次增殖培養(yǎng)基，連續(xù)繼代培養(yǎng)3年以上。