[發明專利]一種用于檢測染色體拷貝數變異的測序文庫構建方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201710476884.1
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107217308A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 商玲;呂萌;陳祥彬;王婷婷;張建光
• 申請（專利權）人: 北京貝瑞和康生物技術股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所11256
• 代理人: 孟凡宏,王月

技術領域

本發明涉及文庫的構建方法和試劑盒，更具體地，本發明涉及用于檢測染色體拷貝數變異的測序文庫構建方法和試劑盒。

背景技術

研究表明，染色體數目的異常在已發現的染色體異常相關疾病中占有很大的比例(Nagaoka,et al,2012)。染色體數目的異常除了可表現為整條染色體的數目改變(染色體非整倍體)，也可表現為某染色體的某一片段的拷貝數變異(如染色體微缺失微重復綜合征)。鑒于染色體異常疾病一般具有高發、危害性嚴重且缺乏有效的治療手段等特點，所以利用技術手段準確檢測染色體拷貝數是否存在異常具有重要的意義。

采用傳統核型分析技術(Karyotyping)結合熒光原位雜交技術(FISH)或染色體微列陣分析技術(Chromosome Microarray Analysis,CMA，如aCGH和SNP-array)是目前臨床上用于檢測染色體拷貝數變異的主要手段和標準(Nord,et al,2015)。上世紀70年代建立起的高分辨率核型分析技術(Yunis,1978；Trask,2002)目前仍是檢測染色體非整倍體、平衡或非平衡性結構重排、較大片段的缺失/重復以及嵌合體等染色體異常的金標準，但其分辨率較低(約為5Mb)，無法檢出具有臨床意義的染色體較小片段的拷貝數變異。而始于上世紀80年代后期的FISH技術(Trask,1991)將細胞遺傳學、免疫學和分子生物學相結合，在臨床研究上檢測目標染色體非整倍體和結構異常等方面具有較好的應用，但是其特異性探針的設計受到對目標區域信息的限制，因而僅能夠得到有限的染色體信息。近年來發展起來的染色體微陣列分析技術(CMA)則是一種高通量檢測基因組DNA拷貝數變異的分子核型分析技術，其中相對成熟的比較基因組雜交(aCGH)技術和單核苷酸多態性基因芯片(SNP array)技術都屬于CMA技術(Manning and Hudgins,2010)。雖然CMA技術相比于傳統核型分析技術具有很高的分辨率(Breman,et al,2012)，但其在臨床應用中需根據公共數據庫中詳盡的染色體異常及相關臨床信息定制微陣列芯片，因此對某些罕見的或數據庫中未涵蓋的微缺失微重復(CNV)的檢測存在不足。而且，目前CMA技術的難度較高和成本相對較高等特點也限制了其在欠發達地區的廣泛應用。因此，為了更廣泛地排查和診斷染色體疾病，需要一種在保證檢測通量和分辨率的前提下能夠準確檢測染色體拷貝數變異的經濟、簡單的方法。

近些年日益成熟的高通量測序技術(Next Generation Sequencing,NGS)因其通量高、準確性高、靈敏性高、自動化程度高和運行成本低等突出的優勢，使其在臨床研究中得到廣泛的應用(Xuan,et al,2013)。目前通過NGS數據檢測CNV最常用的原理是基于計算深度(read-depth)來實現的，即通過將某區段的深度與預先校正得到的理論值進行計算比較以判定該區段是否存在CNV,這種方法對于單端測序和雙端測序都適用(Yoon,et al,2009；Mason-Suares,et al,2016)。在NGS文庫制備的過程中通常會采用標準的PCR來擴增隨機片段，而PCR不可避免的擴增偏好則會對數據的準確性造成影響(van Dijk,et al,2014；Head,et al,2014；Goodwin,et al,2016)。因此，建立一種簡單的不依賴PCR的建庫方法對于提高染色體非整倍性尤其是CNV的檢測準確性至關重要。

發明內容

本發明的目的在于克服傳統檢測染色體拷貝數變異的方法在分辨率、全基因組覆蓋程度、通量和成本等方面的不足，同時克服NGS建庫過程中PCR擴增偏好性帶來的問題，提供了一種不依賴PCR的檢測染色體拷貝數變異的測序文庫構建方法和試劑盒。采用該方法和試劑盒對待測樣本進行染色體拷貝數變異檢測，可實現對染色體非整倍體和染色體微缺失微重復綜合征的篩查和診斷。

在第一個方面，本發明提供一種用于檢測染色體拷貝數變異的測序文庫構建方法，其主要包括以下步驟：

(1)利用雙鏈DNA片段化酶將待測DNA隨機片段化；

(2)對片段化后的DNA進行末端補平和3’端懸A；

(3)將末端補平并3’端懸A的DNA與測序接頭連接，獲得連接產物；

(4)純化所述連接產物，獲得測序文庫，

其中步驟(1)-(3)在單一反應管中完成。圖1示出了根據本發明的方法構建測序文庫的主要步驟。