[發明專利]高效合成融合基因的方法及其應用

在審

• 申請號: 201710476786.8
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107287190A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 謝昌平
• 申請（專利權）人: 上海恩即斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/66
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司11514
• 代理人: 孟凡臣

技術領域

本發明涉及基因合成技術領域，具體涉及一種高效合成融合基因的方法及其應用。

背景技術

當前基因合成主要的方法為兩步合成法，第一步是利用PCR(聚合酶鏈式反應)的方法將引物拼接形成200～800bp(堿基對)的小片段，經過測序驗證無誤后通過將片段拼接成更長的所需片段。常用的將小片段拼接成長片段的方法有連接法，重疊PCR方法，體外重組法等。目前應用最廣泛的是重疊PCR的方法。在該方法中，兩個需要拼接的片段有一個重疊區，可以用于重疊PCR反應時的退火。而在片段的另外兩端分別設計擴增全長的引物，在PCR反應體系中，一個片段將可以利用另外一個片段作為模板延伸，從而得到拼接后的全長的片段序列，而最后擴增全長的引物將整個的全長片段進行擴增得到足夠量以進行后續的克隆工作。

重疊PCR反應的成功與否是得到全長拼接片段的關鍵。由于目前對重疊PCR反應的影響因素并沒有系統的研究與優化，因此重疊反應在日常拼接中的成功率并不高，大約在80％左右。而大部分的優化集中在對重疊PCR反應體系的改變上面。比如使用不同供應商、不同特性的聚合酶；在反應的緩沖液體系中加入不同濃度的鎂離子；使用不同對的退火溫度等。這些方法沒有一個明確的指導原則，沒有明確的優化參數可以進行方向性的判斷，基本上是一個試錯的過程，因而費時費力。

發明內容

本發明提供了一種合成融合基因的方法，包括如下步驟：S1：分析待合成融合的基因序列，確定適合進行退火的區域；S2：在適合進行退火的區域中選擇合適長度的片段，進行各個片段的引物的設計與合成；S3：混合合成的各個片段的引物，然后進行重疊PCR，將各個片段的引物拼接成，得到拼接產物。需要說明的是，S3中，引物分離純化后可以進行克隆測序后驗證。為了提高片段之間的退火效率，從而提高片段的拼接成功率，本發明針對影響退火的序列進行了分析、結合PCR引物的設計原則來優化片段的分段原則。從PCR引物的設計原則借鑒中發現以下因素同樣影響待拼接片段之間的重疊區域的有效性：(1)堿基的比例，也就是重疊區中AT與GC的比例，理想的情況下保持AT與GC的比例在接近1：1有利于片段的退火；(2)區域中復雜的二級結構區域，包括回文區與重復區域等，這些復雜二級結構影響有效的退火；(3)存在過多的連續堿基，比如類似AAAAAAAA等的連續區域。目前該領域的多種常用分子生物學軟件均能分析目的序列并能發現以上的這些序列特征，比如Primer3、Oligo、DNAStar等商業化或開源的免費工具，均能用于發現上述不利的序列因素，從而在后續的拼接片段分段中通過項目設計者來主動避免，因而有效避免了以往的無指導分段的弊端。

在本發明的進一步實施方式中，S1中，確定適合進行退火的區域是根據退火溫度確定，退火溫度為60℃。需要說明的是，退火的區域可以根據需要的Tm(退火溫度)決定，通常認為最佳的Tm為55℃～60℃。

在本發明的進一步實施方式中，S1中，確定適合進行退火的區域是根據Primer3、Oligo或DNAStar等工具進行確定。

在本發明的進一步實施方式中，S2中，合適長度為200～800bp，且保證各片段之間的重疊區域為適合進行退火的區域。需要說明的是，根據適合區域在片段中的位置，選擇合適的長度，注意保持該長度在適合的第一步合成的片段長度范圍之內，比如(200～800bp)，保證各片段之間的重疊區域為上述選擇出的合適退火區，然后按照常規方法進行各個片段引物的設計。

在本發明的進一步實施方式中，在S3后，還包括S4：將拼接產物進行克隆，測序驗證序列正確性。

在本發明的進一步實施方式中，S3中，重疊PCR采用Life technologies公司的Platinum Hifi聚合酶及反應體系，當然其它供應商的類似高保真聚合酶也可使用。

本發明還保護上述合成融合基因的方法在高通量測序基因診斷中融合基因標準品構建中的應用。

本發明還保護上述合成融合基因的方法在基因定量分析中融合基因的標準品構建中的應用。

本發明還保護上述合成融合基因的方法在工程抗體尤其是雙特異性抗體構建中的應用。

本發明還保護上述合成融合基因的方法在多個編碼序列的融合基因表達載體的構建中的應用。

本發明還保護上述合成融合基因的方法在編碼序列與調控元件的融合基因的構建中的應用。

本發明還保護上述合成融合基因的方法在較長基因的合成中的應用。