[發明專利]一種兩段式補料發酵合成微生物油脂的方法

在審

• 申請號: 201710476271.8
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107435055A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 費強;傅容湛;尚龍安
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 王艾華

技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，具體涉及一種兩段補料式發酵合成微生 物油脂的方法。

背景技術

油脂作為一種重要原料，可用于生物柴油、綠色柴油、航空燃油、生物 原油等生物燃料的生產。隨著世界人口的增長，油脂需求量不斷增加。油脂 主要來源為動、植物脂肪，但有限動、植物資源已無法滿足人們的食品和生 活中對各種油脂的需求。開發新的油脂資源并實現其產業化已成為全球共識。

生物燃料的研發又進入一個全新的階段，為應對波動的化石燃料價格、 航空碳稅的征收壓力、航空燃料的巨大需求量，國內、外各大航空公司都在 積極推進生物航空燃油的研發和生產。油脂作為制備生物航油的一種重要原 料，其供應量成為制約生物航油發展的關鍵因素。微生物油脂的開發受到高 度關注并成為國內外研究熱點。

微生物油脂是由酵母、細菌、霉菌和藻類等產油微生物在發酵過程中， 將底物碳源轉化為儲存在菌體內的油脂。相比于傳統的動、植物油脂，微生 物油脂有著生產周期短、生產效率高、易規模化生產等優勢。但價格持續升 高的底物碳源(如糖類)已成為限制該生物技術產業化的主要瓶頸。因此開 發一種可以高效轉化低值碳源合成微生物油脂的發酵策略途已成為降低生產 成本的關鍵。

揮發性脂肪酸，即短鏈脂肪酸，是由乙酸、丙酸和丁酸組成的混合酸。 其各組分比例隨著生產工藝和條件的改變而變化。揮發性脂肪酸主要是通過 厭氧發酵過程利用產酸菌群將城市生活污水、餐廚垃圾、畜禽廢物、農林秸 稈、工業廢水等廢棄物中的碳水化合物和有機物質轉化為由乙酸、丙酸和丁 酸組成的混合液。因此，如能將此低值碳源底物進一步開發用于微生物油脂 的合成，不僅能夠推動廢棄物和揮發性脂肪酸的增資開發利用，而且還將有 效地降低微生物油脂以及其衍生產品的生產成本。

相比較于利用糖類等傳統碳源底物，產油微生物代謝揮發性脂肪酸等有 機碳源的速率較低，使得揮發性脂肪酸合成微生物油脂的得率很不理想(小 于10％)。而且由于高濃度有機物碳源(5g/L以上)對細胞生長有明顯抑制 作用，簡單的高密度批式發酵策略已無法完成揮發性脂肪酸合成微生物油脂 的高密度發酵的目的，從而失去了工業化生產的前景。

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供一種微生物代謝揮發性脂肪酸的 速率較高，而且有機物碳源對細胞生長抑制作用小，從而使得最終得到的細 胞濃度、油脂濃度、油脂得率、油脂產率均高的兩段補料式發酵合成微生物 油脂的方法。同時為現有技術提供一種高效轉化低值揮發性脂肪酸碳源合成 低成本微生物油脂的方法。

為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為：兩段式補料發酵合成微 生物油脂的方法，分兩階段完成，第一階段：首先在發酵培養基中加入 20.0-50.0g/L的糖作為碳源，然后接入淺白隱球菌種子液于發酵培養基中后 在發酵罐中進行發酵培養，以0.5-1.5vvm的流量將無菌空氣連續通入攪拌釜 式發酵罐內，控制發酵罐的攪拌轉速為100-900轉/分鐘，發酵溫度20.0-30.0℃，溶解氧濃度10-40％(通過調節攪拌轉速使溶解氧濃度在 10-40％，以同溫同壓下空氣中的氧在發酵液中的飽和溶解度值為100％為參 照)；并利用氨水調節pH5.0-7.0(如果不用氨水而用氫氧化鈉溶液來調節pH 值時，在發酵過程中需要補給一定量的氮源如氯化銨，以保證發酵過程中微 生物對氮的需求量)；發酵過程中利用在線信號(如溶氧濃度、pH、在線糖 濃度分析儀等)檢測發酵過程中碳源(糖)的消耗量；

第二階段：當溶解氧濃度和pH值同時迅速上升且糖濃度為1.0-5.0g/L 時(在線糖濃度分析儀測量值)后，開始流加揮發性脂肪酸混合液代替糖作 為碳源；同時，利用不含氮的堿性溶液來調節PH值，并停止補加氯化銨和 其它含氮物質，使發酵液中的氮含量逐漸降低至0.01g/L，造成發酵液中氮 源供給不足實現氮限制；隨時監控溶解氧濃度和PH值的變化，當二者的值 同時迅速上升時且揮發性脂肪酸混合液濃度為1.0-5.0g/L時(離線有機酸分 析儀器測量值)，流加揮發性脂肪酸混合液是碳源總濃度在5.0-20.0g/L。微 生物就會將發酵液中的揮發性脂肪酸通過代謝合成轉為生物油脂。

上述兩個階段的發酵溫度和pH值都控制一樣。總發酵培養時間在圖1 中給出了，至于第一階段的發酵時間沒有明確給出，但要求發酵罐中糖濃度 為1.0-5.0g/L時進入第二階段，因此給出總發酵培養時間。

上述的發酵培養基組成和配比及微量元素溶液的組成見表1。

上述所述的糖為葡萄糖、蔗糖等。