[發明專利]一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙及制備方法

在審

• 申請號: 201710475252.3
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107462712A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 宮鵬濤;劉維建;楊正濤;張西臣;李建華;楊舉;李赫;李棕松
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙，同時提供了其及制備方法，用于貓弓形蟲感染的血清檢測，屬于免疫學技術領域。

背景技術

弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種重要的人畜共患寄生蟲病，該病寄生宿主廣泛，可感染所有溫血動物及部分變溫動物和冷血動物。貓是該病的終末宿主同時也是中間宿主。感染弓形蟲的貓，通過排出帶有感染性卵囊的糞便來感染人類及動物等其他中間宿主。OIE將弓形蟲病列為B類人畜共患傳染病。IHA和IFA為國標中規定的檢測方法。可是“國標”方法有著操作復雜、需要專業人員、耗時、檢測條件要求高等諸多缺點，不適合實踐中廣泛推廣。實驗室常用的檢測方法為酶聯免疫吸附試驗（ELISA），該方法適用于具有相關條件的實驗室進行操作。試驗中需要有專門的試驗人員，相關的儀器設備，檢測時間較長等原因，所以不合適用于基層現場操作使用。

免疫膠體金技術是近些年發展較快的一種快速檢測技術。本發明通過膠體金技術來建立一種檢測貓弓形蟲病的免疫膠體金試紙，并進行了實際樣品檢測，為貓弓形蟲檢測及實驗貓的標準制定及標準化奠定基礎，同時為貓弓形蟲病的防治提供技術支持和理論依據。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙，具有速度快、操作簡單、不需特殊儀器等特點，適合臨床中的現場檢測及大規模的流行病學調查。

本發明還公開了一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙的制備方法，利用膠體金標記金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA），弓形蟲表面抗原SAG3包被檢測線（T線），兔抗SPA抗體包被質控線(C線)，以此為基礎研制出本發明的檢測貓弓形蟲感染的免疫膠體金層析試紙條。

本發明涉及的一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙條，包括玻璃纖維、硝酸纖維素膜（NC）、PVC底板、吸水板；其特征在于：

金標墊上的金標抗體為金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA），硝酸纖維素膜上的檢測線（T）包被弓形蟲表面抗原SAG3、質控線（C）包被兔抗SPA抗體，建立了一種膠體金試紙條檢測方法。

本發明涉及的一種檢測貓弓形蟲感染免疫膠體金層析試紙條的制備方法，是通過表達純化SAG3重組蛋白，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金溶液對SPA進行標記，制備金標墊，組裝試紙條。弓形蟲表面抗原SAG3為檢測線（T）、兔抗SPA抗體作為質控線（C），主要包括：

1、重組蛋白SAG3誘導表達

（a）取3μL原核表達的SAG3菌液，5μL卡那霉素置于5mL的 LB培養基中，轉入37℃恒溫振蕩培養箱中，150r/min，振蕩過夜；

（b）取振蕩過夜的菌液轉移至300mL的LB培養基中，同時加入300μL的卡那霉素，封口后轉入37℃恒溫震蕩培養箱中進行恒溫振蕩培養，1.5h~2h；

（c）加入300μL的IPTG進行誘導，4~5h后4℃離心機7000r×7min，收集菌液；

（d）取PBS對步驟c）收集的菌液進行重懸，超聲破碎，離心棄上清；

（e）用2mol/L尿素對沉淀進行充分吹打溶解后離心，棄上清；反復進行5次；

（f）用8mol/L尿素對洗后的沉淀進行溶解；

（g）離心后，取上清即得；

2、SAG3重組蛋白的純化

（a）將透析袋放入去離子水浸泡5min激活；

（b）取重組蛋白放入激活的透析袋中密封；

（c）將透析袋加入6mol/L尿素溶液中，4℃條件下進行攪拌透析5h；

（d）按第（3）步分別通過4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L尿素進行梯度透析，用PBS將尿素置換；

（e）將步驟4）產物4℃、12000 r/min條件下離心5min，取上清-20℃保存；

（f）SDS-PAGE電泳；

3、膠體金試紙條的制備

取21mm的NC膜貼于PVC底板上；金標墊壓在NC膜上，樣品墊壓在金標墊上，吸水紙壓在NC膜上粘在底板上；取試紙條進行抗體的包被劃線，檢測線（T）劃純化的SAG3蛋白、質控線（C）劃兔抗SPA抗體。

本發明的積極效果在于：