[發(fā)明專利]一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙及制備方法

在審

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• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107462712A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發(fā)明（設計）人: 宮鵬濤;劉維建;楊正濤;張西臣;李建華;楊舉;李赫;李棕松
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙，包括玻璃纖維、硝酸纖維素膜（NC）、PVC底板、吸水板；其特征在于：

金標墊上的金標抗體為金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA），硝酸纖維素膜上的檢測線（T）包被弓形蟲表面抗原SAG3、質(zhì)控線（C）包被兔抗SPA抗體。

2. 權(quán)利要求1所述的一種檢測貓弓形蟲感染的膠體金免疫層析試紙的制備方法，其特征在于：通過表達純化SAG3重組蛋白，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金溶液對SPA進行標記，制備金標墊，組裝試紙條；其中，

1）重組蛋白SAG3誘導表達

（a）取3μL原核表達的SAG3菌液，5μL卡那霉素置于5mL的 LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，150r/min，振蕩過夜；

（b）取振蕩過夜的菌液轉(zhuǎn)移至300mL的LB培養(yǎng)基中，同時加入300μL的卡那霉素，封口后轉(zhuǎn)入37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中進行恒溫振蕩培養(yǎng)，1.5h~2h；

（c）加入300μL的IPTG進行誘導，4~5h后4℃離心機7000r×7min，收集菌液；

（d）取PBS對步驟c）收集的菌液進行重懸，超聲破碎，離心棄上清；

（e）用2mol/L尿素對沉淀進行充分吹打溶解后離心，棄上清；反復進行5次；

（f）用8mol/L尿素對洗后的沉淀進行溶解；

（g）離心后，取上清即得；

2）SAG3重組蛋白的純化

（a）將透析袋放入去離子水浸泡5min激活；

（b）取重組蛋白放入激活的透析袋中密封；

（c）將透析袋加入6mol/L尿素溶液中，4℃條件下進行攪拌透析5h；

（d）按第（3）步分別通過4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L尿素進行梯度透析， 用PBS將尿素置換；

（e）將步驟4）產(chǎn)物4℃、12000 r/min條件下離心5min，取上清-20℃保存；

（f）SDS-PAGE電泳；

3）膠體金試紙條的制備

取21mm的NC膜貼于PVC底板上；金標墊壓在NC膜上，樣品墊壓在金標墊上，吸水紙壓在NC膜上粘在底板上；取試紙條進行抗體的包被劃線，檢測線（T）劃純化的SAG3蛋白、質(zhì)控線（C）劃兔抗SPA抗體。