[發明專利]一種植物乳桿菌來源的苯丙酮酸還原酶及應用

在審

• 申請號: 201710474277.1
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107164341A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 李劍芳;袁風嬌;劉艷;李雪晴;鄔敏辰;李闖
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N1/21;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種植物乳桿菌來源的苯丙酮酸還原酶及應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)，又名2-羥基-3苯基丙酸，是一類非常重要的化合物，在醫藥及生物防腐劑等方面具有非常廣泛的應用。苯乳酸具有與其衍生物丹參素(β-3，4一二羥基苯基乳酸鈉)相同的藥理功能，可以調節人體內的類固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成許多藥物的重要中間物，比如：降血糖藥恩格列酮(Englitazone)、非蛋白氨基酸施德丁(Statine)、抗艾滋病毒制劑、新型驅腸蟲藥PFl022A等。此外，近年來發現苯乳酸可作為新型的生物防腐劑，且具有非常廣泛的抗菌譜，對革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌、單核增生性李斯特菌)、革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、沙門氏菌)和真核微生物(如曲霉青霉)等均有抑制作用。而苯乳酸生物制備法因其具有高效性、高對映選擇性、高區域選擇性、反應條件溫和、適用范圍廣及環境友好等眾多的優點備受研究者關注。因此，苯乳酸及其催化合成的酶類成為近年來研究的熱點。

1988年，Lavermicocca等從酸面團中分離得到的L.plantarum 21B,產生的D-苯乳酸量為56mg/L,這是首次關于乳酸菌產生苯乳酸的報道。隨后研究人員陸續發現不同種屬的乳酸菌能夠產生苯乳酸，如李興峰等從泡菜中篩選出112株菌，其中有10株菌產生D-苯乳酸的量超過66.4mg/L。但是由于原始菌株的局限性，其產生苯乳酸的量一般都不高，且不同菌株之間有較大差異，難以達到工業產業化要求。

現有技術中，有研究者發現苯丙酮酸還原酶在催化苯丙酮酸反應12h后，苯丙酮酸的轉化率為91.3％。也有研究者應用Lactobacillusplantarum CECT-221生產苯乳酸，在優化后的培養條件下，2L的發酵罐中發酵培養158h，苯乳酸產量僅為0.7g/L。由此可以看出，采用發酵法制備苯乳酸的產率較低，產物提取困難，而生物轉化法制備苯乳酸的底物上載量和產率均有所提高，但是反應時間過長，仍不能達到工業化生產的要求,需要進一步開發高效還原酮酸的酶類。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種苯丙酮酸還原酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明的第二個目的是提供編碼所述苯丙酮酸還原酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明的第三個目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達SEQ ID NO.1所示苯丙酮酸還原酶基因。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以pET-28a(+)為載體表達所述苯丙酮酸還原酶基因。

在本發明的一種實施方案中，所述的宿主為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌按如下步驟構建：(1)將SEQ ID NO.1所示基因片段與與pUCm-T連接后轉化宿主E.coli JM109，獲得重組質粒命名為pUCm-T-lpppr；(2)將pUCm-T-lpppr與pET-28a(+)質粒均用Nde I和Not I進行雙酶切，在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pET-28a(+)-lpppr；(3)將pET-28a(+)-lpppr轉化入E.coli BL21(DE3)宿主。

本發明的第四個目的是提供所述基因的異源表達方法，所述方法是將所述基因工程菌接種至LB培養基中，于37℃、轉速220rpm培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.4-0.6mM進行誘導，18～22℃誘導表達7～9h。