[發(fā)明專利]一種植物乳桿菌來源的苯丙酮酸還原酶及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710474277.1
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN107164341A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李劍芳;袁風(fēng)嬌;劉艷;李雪晴;鄔敏辰;李闖
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04;C12N15/53;C12N1/21;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

1.一種苯丙酮酸還原酶，其特征在于，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

2.編碼權(quán)利要求1所述的苯丙酮酸還原酶的基因。

3.一種基因工程菌，其特征在于，以大腸桿菌為宿主，表達(dá)SEQ ID NO.2所示的苯丙酮酸還原酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以pET-28a(+)為載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的基因工程菌，其特征在于，宿主為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。

6.構(gòu)建權(quán)利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)將SEQ ID NO.1所示基因片段與與pUCm-T連接后轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，獲得重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-lpppr；(2)將pUCm-T-lpppr與pET-28a(+)質(zhì)粒均用Nde I和Not I進(jìn)行雙酶切，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)-lpppr；(3)將pET-28a(+)-lpppr轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)。

7.一種產(chǎn)苯丙酮酸還原酶的方法，其特征在于，將表達(dá)權(quán)利要求1所述苯丙酮酸還原酶的基因工程菌接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6～0.8，加入終濃度為0.4-0.6mM的IPTG，于18～22℃誘導(dǎo)表達(dá)7～9h。

8.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述苯丙酮酸還原酶制備D-苯乳酸的方法，其特征在于，是將苯丙酮酸還原酶以16～25U/mmol苯丙酮酸的添加量加入至含葡萄糖和苯丙酮酸的反應(yīng)體系中，所述苯丙酮酸和葡萄糖的質(zhì)量比為1：0.8～1。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述苯丙酮酸是以酶液、酶粉或基因工程菌的形式參與反應(yīng)。

10.權(quán)利要求3所述的基因工程菌在食品、生物、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。