[發(fā)明專利]一種基于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法

有效

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• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107099612B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設計）人: 李富榮;凌凱;李聰;蔣太峰;衛(wèi)志堅;戴蘡瓔
• 申請（專利權）人: 深圳市展行生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6834;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明公開了一種基于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法，通過特異性識別并切割未配對單鏈核酸和堿基錯配雙鏈核酸的能力，檢查核酸探針與目標miRNA雜交中發(fā)生的錯配和部分互補；然后利用結合到核酸探針上的辣根過氧化物酶與化學發(fā)光底物發(fā)生的酶促反應產生熒光，快速放大檢測信號，根據熒光強度確定目標miRNA含量，其檢測結果準確可靠，操作簡便易行，具有成本低、高通量、無需進行核酸提取與擴增等優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明涉及癌癥醫(yī)療診斷技術領域，具體為一種基于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法。

背景技術

微小RNA(miRNA)是一類進化上保守內源性非蛋白質編碼的RNA分子，長約20至24個核苷酸，能夠識別特定的目標信使RNA(messagerRNA,mRNA)，并在轉錄后水平負調控基因。miRNA通過切割或抑制特定mRNA來負調控靶基因,廣泛參與調控個體發(fā)育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動。如果miRNA以腫瘤抑制基因或者癌基因為靶向，miRNA的失常就能影響腫瘤形成。由于超過半數(shù)的miRNA基因位于腫瘤相關基因組區(qū)域或脆弱位點，異常表達的miRNA和多種腫瘤的發(fā)生，分期，轉移和復發(fā)有著密切關系。

miR-21和miR-17-92家族被報道是與腫瘤關系最密切且具有癌基因功能的miRNA，在包括肺癌、淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中表達增強。研究表明，miR-21通過調節(jié)基因PETN、PDCD4的抗凋亡活性，抑制腫瘤細胞的凋亡；將隨著腫瘤惡性程度的增高，表達增強。同樣，miR-17-92家族在肺癌中的高表達尤其是SCLC發(fā)展過程中起著十分重要的作用。miR-17-92家族在肺癌早期表達升高，但是隨著肺癌的發(fā)展，其表達下降；并且通過抑制miR-17-92家族的表達可以抑制肺癌的發(fā)展并誘導其凋亡。目前，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可作為一種新生物標志物，用于腫瘤的早期診斷和預后預測。但由于臨床上缺乏成本低廉、操作簡便的高通量miRNA檢測技術。使得這一新標記物診斷方法目前僅存在于“實驗室階段”。

PCR技術是目前最常用miRNA檢測技術，但是miRNA的長度僅約22個核苷酸，通常

在反轉錄時需要對miRNA加尾或者進行引物的延伸處理，得到一個較長的反轉錄擴增因子，為PCR提供合適的模板。但是，目標miRNA的超小尺寸導致要使用過短的寡核苷酸鏈引物，造成了解鏈溫度(MeltingTemperature,Tm)的降低，影響了擴增的效率；其結果還可能會受miRNA前體(miRNAprecursor,pre-miRNA)的干擾。目前用于miRNA檢測的PCR技術主要為stem-loop莖環(huán)法和PolyA加尾法，這兩種方法在檢測原理上存在差異。stem-loop莖環(huán)法是先設計一種具有特殊的莖環(huán)結構反轉錄引物，在反轉錄過程中完成模板鏈的延長；而PolyA加尾法是對目標miRNA采用多聚腺苷酸聚合酶在其末端加上一段PolyA尾，再采用常用的oligo(dT)反轉錄引物進行反轉錄，從而得到較長的模版鏈。這兩種方法在檢測特異性和檢測通量上存在成本高、操作復雜等缺陷，阻礙了其臨床應用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法，檢測結果準確可靠，操作簡便易行，具有成本低、高通量、無需進行核酸提取與擴增等優(yōu)點，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種基于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法，方法包括以下步驟：

S1：提取miRNA，使用ProteinaseK消化血清中與miRNA結合的蛋白質，并通過Tween20表面活性劑破壞細胞外囊泡的脂質雙層膜，使血清中的miRNA游離出來；

S2：提取核酸探針，將與目標miRNA互補配對的長段核酸探針分為兩個部分，即兩個短核苷酸鏈探針，分別為核酸探針1和核酸探針2；