[發(fā)明專利]一種基于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710473065.1
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107099612B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李富榮;凌凱;李聰;蔣太峰;衛(wèi)志堅(jiān);戴蘡瓔
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市展行生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6834;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種用于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法的裝置，其特征在于，方法包括以下步驟：

S1：提取miRNA，使用ProteinaseK消化血清中與miRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并通過Tween20表面活性劑破壞細(xì)胞外囊泡的脂質(zhì)雙層膜，使血清中的miRNA游離出來；

S2：提取核酸探針，將與目標(biāo)miRNA互補(bǔ)配對的長段核酸探針分為兩個部分，即兩個短核苷酸鏈探針，分別為核酸探針1和核酸探針2；

S3：在馬來酸酐化96孔酶標(biāo)板上通過酰胺反應(yīng)連接一段DNA捕獲序列，并加入處理后的血清樣品、核酸探針1和核酸探針2，使兩個短核苷酸鏈探針分別與目標(biāo)miRNA序列中的一半互補(bǔ)配對；

S4：通過核酸雜交將核酸探針1、血清中的目標(biāo)miRNA及核酸探針2固定在酶標(biāo)板上；S5：通過反復(fù)沖洗酶標(biāo)板，去除錯配和部分互補(bǔ)的miRNA，進(jìn)一步提高其檢測體系的特異性；

S6：將S5中沖洗后的酶標(biāo)板上的序列與Biotin標(biāo)記的信號放大序列雜交，用SA-HRP與信號放大序列上的Biotin標(biāo)記結(jié)合，并加入化學(xué)發(fā)光底物溶液；

S7：根據(jù)熒光強(qiáng)度確定血清中目標(biāo)miRNA的表達(dá)量，從而檢測出目標(biāo)miRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法的裝置，其特征在于，所述目標(biāo)miRNA序列為長度22個的堿基，其一半即11個堿基與一個短核苷酸鏈探針配對雜交出現(xiàn)錯配和部分互補(bǔ)，產(chǎn)生較弱的結(jié)合方式。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法的裝置，其特征在于，所述DNA捕獲序列和信號放大序列設(shè)計(jì)參照Luminex液相芯片的TAG序列設(shè)計(jì)，其通過核酸雜交把核酸探針固定，并且序列與序列及序列與生物樣本中的核酸成分之間由BLAST程序比對驗(yàn)證，不會發(fā)生核酸雜交。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法的裝置，其特征在于，所述miRNA分為miR-16和miR-21，miR-16為一種在血液中表達(dá)較為恒定的miRNA標(biāo)志物，其作為血清miRNA表達(dá)變化的內(nèi)參物質(zhì)；miR-21為一種普遍在癌癥患者血液中高表達(dá)的miRNA標(biāo)志物，其作為非小細(xì)胞肺癌患者血清中的生物標(biāo)志物。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法的裝置，其特征在于，所述方法檢測miRNA的線性范圍在10fM至50pM之間，最低能檢測1.248fM濃度的miRNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于短核苷酸鏈連接檢測癌癥患者血清miRNA的方法的裝置，其特征在于，所述S7中的熒光強(qiáng)度來源于化學(xué)發(fā)光底物溶液與結(jié)合到核酸探針上的辣根過氧化物酶產(chǎn)生的酶促反應(yīng)，通過熒光強(qiáng)度進(jìn)一步放大檢測信號。