[發(fā)明專利]一種利用DNA探針配體電化學檢測STAT3蛋白活化水平的方法和應用

在審

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• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107144618A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設計）人: 孫麗洲;殷婷婷;黃歡
• 申請（專利權）人: 孫麗洲
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/416;G01N27/48
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷

技術領域

本發(fā)明屬于分子診斷與產科高危妊娠檢測領域，涉及一種利用DNA探針配體電化學檢測STAT 3蛋白活化水平的方法和應用。

背景技術

目前，對于蛋白質活化水平的檢測分析主要依靠的仍然是傳統(tǒng)的免疫學方法如Western Blotting和ELISA等；STAT 3蛋白活化水平的檢測也主要是通過這兩種方法。但這些依賴于抗原抗體識別機制的經典方法存在著不同程度的局限性，如抗體高度復雜的化學結構、繁復的制備工藝和昂貴價格、操作繁瑣，費時且需要接觸放射性物質等。隨著對疾病相關的蛋白質標記物特異性檢測興趣的與日俱增，除了基于抗原-抗體結合的免疫分析，另一類基于核酸適配體化學合成配基的蛋白質生物傳感器也得到了巨大的關注，盡管兩者互相補充相輔相成，但對蛋白質標記物活化水平的檢測在靈敏度、選擇性、響應速度等諸多方面仍面臨新的挑戰(zhàn)：其一，單一配體如抗體和靶蛋白之間僵硬的一比一結合作用容易造成信號的衰減，影響新型信號放大策略的進一步引入；其二，利用兩種不同配體分別識別靶蛋白上不同結構域而設計的“三明治”檢測體系普適性較差，應用范圍比較局限，因為并非所有靶蛋白均可以具備滿意的“三明治”結合位點?；诂F(xiàn)有的蛋白質分析檢測技術普遍存在靜態(tài)、低效、低時空分辨等缺點，難以滿足生命科學研究及臨床醫(yī)學檢驗的需求。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種新穎的不依賴于抗體、對STAT 3蛋白活化水平進行檢測和分析的電化學方法。

本方法的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的：

選用可以與STAT3特異性結合的“誘餌寡核苷酸序列”(decoy oligonucleotide,Decoy ON)取代傳統(tǒng)的抗體，與一條互補DNA序列一起作為識別捕獲靶標STAT3蛋白的DNA探針自組裝于電極表面，所述的DNA探針與活化后的STAT3蛋白結合；通過DNA工具酶切除未與STAT3蛋白結合的DNA探針，再選用特殊磷酸化肽Ac-(pY)LPQTV-NH₂結合靶標蛋白STAT3釋放DNA探針，之后加入Zr⁴⁺以及磷酸化納米石墨烯復合信標，通過Zr⁴⁺與磷酸基團間穩(wěn)定的配位交聯(lián)作用將磷酸化納米石墨烯復合信標與釋放DNA探針相連接，標記在電極表面，最后利用納米石墨烯裝載的大量磷酸基團配位大量三價鐵離子催化鄰苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)氧化產生大量電化學活性分子2,3-二氨基吩嗪(2,3-diaminophenazine,DAP)，實現(xiàn)電極表面信號的多重放大。

所述的誘餌寡核苷酸序列修飾于電極上，其序列的5’端均修飾有巰基基團，與它們相互補的DNA序列的5’端有磷酸基團修飾。序列如下：捕獲探針STAT 3Decoy ON：5’-SH-Spacer18-CATTTCCCGTAAATC-3’，和它的互補序列：5’-HPO₄-GATTTACGGGAAATG-3’，該DNA探針是一段與STAT 3靶基因啟動子順式作用元件序列相一致，又比后者具有更卓越親和力的雙鏈短核苷酸，可以和STAT 3蛋白活化二聚體特異性結合。

所述的DNA探針自組裝于電極表面的方法為誘餌寡核苷酸序列在10mM三氯乙基磷酸酯溶液中室溫孵育1小時，以去除探針DNA分子間或分子內的二硫鍵，將誘餌寡核苷酸序列及其互補DNA序列在95℃水浴鍋中加熱5分鐘，后緩慢退火降至室溫，將金電極浸入到含0.2μM退火所得雙鏈DNA的DNA固定緩沖液中，再通過Au-S鍵的共價作用，使DNA探針自組裝在金電極表面形成一個致密的單分子層；所述的DNA固定緩沖液配方為10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，10mMTCEP，0.2μM退火所得雙鏈DNA，pH 7.4。

將金電極浸入到活化后的STAT 3蛋白溶液中溫育，電極上DNA探針可以捕獲結合活化的STAT 3二聚體，STAT 3蛋白和電極上的DNA捕獲探針間的溫育時間不少于120分鐘。

所述的DNA工具酶即DNaseⅠ內切酶，對雙鏈DNA具有切割活性，將沒有結合有STAT 3蛋白活化二聚體的、仍然裸露于電極上的過量DNA探針全部從電極界面上切除。DNaseⅠ酶切反應時間定為不少于30分鐘。