[發(fā)明專利]一種利用DNA探針配體電化學(xué)檢測STAT3蛋白活化水平的方法和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710470274.0
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107144618A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫麗洲;殷婷婷;黃歡
• 申請（專利權(quán)）人: 孫麗洲
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/416;G01N27/48
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司32218
• 代理人: 傅婷婷

1.一種不依賴于抗體、對STAT3蛋白活化水平進(jìn)行檢測的電化學(xué)方法，其特征在于選用與STAT3蛋白特異性結(jié)合的“誘餌寡核苷酸序列”取代傳統(tǒng)的抗體，與一條互補(bǔ)DNA序列一起作為識別捕獲靶標(biāo)STAT3蛋白的DNA探針自組裝于電極表面，所述的DNA探針與活化后的STAT3蛋白結(jié)合；通過DNA工具酶切除未與STAT3蛋白結(jié)合的DNA探針，選用特殊磷酸化肽Ac-(pY)LPQTV-NH₂結(jié)合靶標(biāo)蛋白STAT3釋放DNA探針后，加入Zr⁴⁺以及磷酸化納米石墨烯復(fù)合信標(biāo)，通過Zr⁴⁺與磷酸基團(tuán)間穩(wěn)定的配位交聯(lián)作用將磷酸化納米石墨烯復(fù)合信標(biāo)與釋放的DNA探針相連接標(biāo)記在電極表面，最后利用納米石墨烯裝載的大量磷酸基團(tuán)配位大量三價鐵離子催化鄰苯二胺氧化產(chǎn)生電化學(xué)活性分子2,3-二氨基吩嗪，使電極表面信號被放大，通過電化學(xué)方法檢測被放大的電極表面信號，從而實(shí)現(xiàn)對STAT3蛋白活化水平的檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于“誘餌寡核苷酸序列”的5’端修飾有巰基基團(tuán)，序列為5’-SH-Spacer18-CAT TTC CCG TAA ATC-3’；所述的互補(bǔ)DNA序列的5’端有磷酸基團(tuán)修飾，序列為5’-HPO₄-GAT TTA CGG GAA ATG-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于所述的DNA探針自組裝于電極表面的方法為誘餌寡核苷酸序列在10mM三氯乙基磷酸酯溶液中室溫孵育1小時，以去除探針DNA分子間或分子內(nèi)的二硫鍵，將誘餌寡核苷酸序列及其互補(bǔ)DNA序列在95℃水浴鍋中加熱5分鐘，后緩慢退火降至室溫，將金電極浸入到含0.2μM退火所得雙鏈DNA的DNA固定緩沖液中，再通過Au-S鍵的共價作用，使DNA探針自組裝在金電極表面形成一個致密的單分子層；所述的DNA固定緩沖液配方為10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，10mMTCEP，0.2μM退火所得雙鏈DNA，pH 7.4。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于電極表面的DNA探針與活化后的STAT3蛋白溫育時間不少于2小時，電極上DNA探針捕獲結(jié)合活化的STAT3二聚體實(shí)現(xiàn)DNA探針與活化后的STAT3蛋白的結(jié)合。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于所述的DNA工具酶選用DNaseⅠ內(nèi)切酶，將沒有與STAT3蛋白結(jié)合的、仍然裸露于電極上的過量DNA探針全部從電極界面上切除。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的電化學(xué)方法，其特征在于DNaseⅠ內(nèi)切酶切割DNA探針的酶切時間不少于30分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于所述的特殊磷酸化肽Ac-(pY)LPQTV-NH₂結(jié)合靶標(biāo)蛋白STAT3釋放DNA探針是將捕獲有靶標(biāo)蛋白STAT3的電極溶解于多肽反應(yīng)溶液中，孵育時間不少于1小時釋放DNA探針，然后使用加入含有0.5％Tween-20的Tris-HCl緩沖液沖洗電極；其中，所述的多肽反應(yīng)溶液為1μM Ac-(pY)LPQTV-NH₂，10mM TCEP，10mM TBS，pH7.4。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于所述的磷酸化納米石墨烯復(fù)合信標(biāo)由修飾有磷酸基團(tuán)的1-芘甲胺鹽酸鹽與氧化石墨烯混勻制備而成，STAT 3洗脫后的電極與磷酸化納米石墨烯復(fù)合信標(biāo)溫育時間不少于1小時。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于將已標(biāo)記有磷酸化納米石墨烯復(fù)合信標(biāo)的電極置于FeCl₃反應(yīng)溶液中，在室溫下靜置1小時，用100mM HCl溶液和雙蒸水依次沖洗電極終止反應(yīng)并去除非特異性吸附，加入H₂O₂并將電極浸入到1mL的Tris-HCl反應(yīng)溶液中，50℃水浴30分鐘；所述的FeCl₃反應(yīng)溶液為50μM FeCl₃，100mM HCl，pH 7.0的水溶液；所述的Tris-HCl反應(yīng)溶液為20mM Tris，2.5mg鄰苯二胺，pH 7.5。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)方法，其特征在于利用三電極系統(tǒng)檢測被放大的電極表面信號，即飽和甘汞電極為參比電極，金電極作為工作電極，鉑柱電極作為對電極使用，電化學(xué)方法為交流阻抗法和方波伏安法：交流阻抗法中工作電解液為含5mM的[Fe(CN)₆]^3-/4-、0.1M KCl的10mM Tris-HCl溶液(pH 7.4)，掃描參數(shù)為：初始電平0.224V，振幅5mV，高頻10KHz，低頻0.1KHz；方波伏安法中電化學(xué)工作液為10mM pH 7.4的Tris-HCl溶液，掃描范圍從-0.7V到-0.2V，電位增量設(shè)置為4mV，方波振幅為25mV，方波頻率是15Hz；三電極系統(tǒng)開始工作前和全程中，電解液均處于氮?dú)鈿夥罩小?!-- SIPO -->