[發明專利]草酸脫羧酶的制備及其制品和應用

在審

• 申請號: 201710467815.4
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107868775A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 宋保平;劉海峰;陳火晴;陳先橋;童佩;汪小鋒
• 申請（專利權）人: 武漢康復得生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N1/14;A23L31/00;A23L33/10;A23K10/30;A23K20/189;A61K38/51;A61P13/04;A61P13/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司11228
• 代理人: 程殿軍,張瑾

技術領域

本申請涉及一種草酸脫羧酶的制備及其制品和應用。

技術背景

草酸(oxalic acid)是一種分子式為C₂O₄H₂、分子量為90.04的二元有機酸，存在于常見的絕大多數食物中，在特定食物(如菠菜或其它綠色蔬菜、竹筍、綠茶、可可豆、豆漿和咖啡等)中含量很高。草酸在生物體內為最終產物，不能被進一步分解，主要排泄方式是隨尿液一起排出。人體中的草酸包括外源性草酸和內源性草酸，外源性草酸是指通過飲食攝入的草酸，內源性草酸是指人體肝臟自身代謝產生的草酸。腎結石高發人群的外源性草酸遠遠大于內源性草酸。

當人體尿液中的草酸含量過高時，容易與鈣離子形成不溶性的草酸鈣晶體，草酸鈣晶體很容易在膀胱、腎臟等器官內沉積形成結石。 II型高草酸尿癥是指食源性草酸吸收異常，導致尿草酸較正常人偏高，是原發性高草酸尿癥外導致結石的重要因素，因此，控制從飲食中攝取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸量，從而降低患結石風險。低草酸飲食或降解食物中草酸的防治草酸鈣結石的策略在醫學界已成為共識。飲食中草酸主要在胃中被釋放出來，濃度也相對較高，非常有利于酶法降解去除，但是胃中的低pH值環境及胃蛋白酶對草酸降解酶的活力有很大的挑戰，因此尋找能食用的，且在胃腸道pH 值環境下能高效降解草酸的酶成為此治療技術的關鍵。

目前已發現的具有分解草酸功能的酶，有草酸脫羧酶(以下簡稱“OXDC”)、草酸氧化酶和草酰CoA脫羧酶。OXDC的作用是催化草酸分解為甲酸和二氧化碳。迄今已知，已有報道的OXDC主要來自芽孢桿菌(Bacillus)屬、曲霉(Aspergillus)屬、金針菇(Flammulina velutipes)，云芝(Coriolus versicolor)，白腐菌(Trametes versicolor)等。其中除了金針菇具有食用歷史外，其余的均不是食用菌，因此，大劑量，長時間的服用有潛在的風險。而且天然生長的菌中雖然含有草酸降解酶，但是其含量非常低，僅為1～5U/g干菌重，而要能達到口服后降低食源性草酸吸收的效果，人每次服用量要達到 300U以上，所以天然生長或常規人工培養的食用菌無法滿足要求。

發明內容

為了解決現有技術中，田頭菇屬食用菌草酸脫羧酶正常表達量低，無法產業化的技術問題，本發明提供一種草酸脫羧酶的制備方法，還提供使用該方法制備的制品及其應用。

本發明涉及一種草酸脫羧酶的制備方法，所述方法使用生物發酵技術手段，在0.001-50mM錳離子條件下，采用酸誘導表達，生產草酸脫羧酶。生產草酸脫羧酶用的菌種來源于田頭菇屬食用菌。在具體實施方式中，生產草酸脫羧酶用的菌種為田頭菇屬(Agrocybe)食用菌菌種，包括：茶樹菇(Agrocybe aegerita)，楊樹菇(Agrocybe Cylindracea)，田頭菇(Agrocybe praecox(Pers.)Fayod)，半圓田頭菇(Agrocybe pediades(Fr.)Fayod)，楊柳田頭菇 (Agrocybe salicacola)等，優選為茶樹菇(Agrocybe aegerita)，楊樹菇(Agrocybe Cylindracea)，更優選為茶樹菇(Agrocybe aegerita)。

在一個具體實施方式中，所述的草酸脫羧酶的制備方法，誘導產酶時調節發酵液pH值到pH值3.2～4.0、pH值3.0～3.6、pH值2.8～ 3.2、pH值2.6～3.0或pH值2.0～2.8；優選為pH值2.6～3.0或 pH值2.8～3.2，更優選為pH值2.8～3.2；調節發酵液pH值用的酸為有機酸或無機酸，優選為磷酸，鹽酸，檸檬酸，草酸，更優選為磷酸，鹽酸。

一個具體實施方式中，所述的草酸脫羧酶的制備方法誘導產酶時加入的含錳離子的物質包括MnCl₂、MnSO₄、MnCO₃、Mn(NO₃)₂和/或 Mn(CH₃COO)₂；加入的錳離子的濃度為0.001～0.1mM、0.1～1mM、1～ 2mM、2～4mM、4～6mM、6～10mM或10～50mM，優選濃度為1～2mM、 2～4mM、4～6mM或6～10mM，更優選為2～4mM或4～6mM。

在一個具體實施方式中，所述草酸脫羧酶的制備方法，誘導產酶階段補加培養基，補料培養基成分中含有谷氨酸，精氨酸，天冬氨酸或者谷胱甘肽物質。