[發(fā)明專利]一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用

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• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN107916244A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹遠(yuǎn)東;曾二生;潘烘;周華嬌;易松強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 江西嘉博生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;A23K10/18;A61K38/48;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司36115
• 代理人: 謝德珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

溶葡球菌素是一種對(duì)葡萄球菌溶菌作用的抗菌酶，具有水解葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖 gly 五肽橋聯(lián)的催化活性，近年來葡萄球菌尤其是金黃色葡萄球菌的耐藥狀況日益嚴(yán)重，溶葡球菌素的藥用潛力更加受到人們重視，同時(shí)葡萄球菌病給畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成巨大危害，因此應(yīng)用溶葡球菌素預(yù)防和治療畜禽葡萄球菌病具有廣闊的應(yīng)用前景。

乳酸乳球菌做為一種益生菌，對(duì)機(jī)體的健康十分重要，它能產(chǎn)生多種代謝酶類和維生素，促進(jìn)畜禽消化，抑制有害菌繁殖并改變腸道內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腸道健康，提高畜禽生產(chǎn)性能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明其目的就在于提供一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用，本發(fā)明既可發(fā)揮乳酸乳球菌的益生菌功效，又可發(fā)揮豬溶葡球菌素殺滅腸道內(nèi)葡萄球菌，預(yù)防和治療葡萄球菌病的功效。

為實(shí)現(xiàn)上述目的而采取的技術(shù)方案是，

一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌，重組乳酸乳球菌為Lysostaphin-pNZ8148-NZ9000。

一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

（1）按照宿主菌乳酸乳球菌的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化而合成溶葡球菌素 （Lysostaphin ）基因與乳酸乳球菌（ pNZ8148）質(zhì)粒；

（2）用限制性內(nèi)切酶分別對(duì)溶葡球菌素 （Lysostaphin ）基因與乳酸乳球菌（ pNZ8148）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收，再經(jīng) T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 MC1061 感受態(tài)細(xì)胞中；

（3）使用氯霉素抗性進(jìn)行篩選后，提取重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZ9000中，PCR 鑒定正確，得到重組乳酸乳酸球菌 Lysostaphin-pNZ8148-NZ9000；

（4）Western Blot鑒定重組乳酸乳球菌的表達(dá)結(jié)果。

一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌的應(yīng)用，所述的重組乳酸乳球菌Lysostaphin-pNZ8148-NZ9000全培養(yǎng)基可直接飼喂動(dòng)物，既可發(fā)揮乳酸乳球菌的益生菌功效，又可發(fā)揮豬溶葡球菌素殺滅腸道內(nèi)葡萄球菌，預(yù)防和治療葡萄球菌病的功效。

有益效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明公開的優(yōu)點(diǎn)是，可經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生溶葡球菌素，該重組菌全培養(yǎng)基直接飼喂動(dòng)物，既可發(fā)揮乳酸乳球菌的益生菌功效，又可發(fā)揮豬溶葡球菌素殺滅腸道內(nèi)葡萄球菌，預(yù)防和治療葡萄球菌病的功效。

附圖說明

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

圖1為篩選溶葡球菌素基因與 pNZ8148 質(zhì)粒連接的陽性克隆子電泳圖（引物L(fēng)ysostaphin-F 和 Lysostaphin-R，產(chǎn)物約768bp）；

圖2為乳酸乳球菌 NZ9000 表達(dá) Lysostaphin 蛋白的western blot圖（蛋白大小在 27KD 左右）；

圖3為 pNZ8148 質(zhì)粒圖譜。

具體實(shí)施方式

一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌，重組乳酸乳球菌為Lysostaphin-pNZ8148-NZ9000。

所述的質(zhì)粒為pNZ8148。

一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌的構(gòu)建方法，如圖1-3所示，包括以下步驟：

（1）按照宿主菌乳酸乳球菌的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化而合成溶葡球菌素 （Lysostaphin ）基因與乳酸乳球菌（ pNZ8148）質(zhì)粒；

（2）用限制性內(nèi)切酶分別對(duì)溶葡球菌素 （Lysostaphin ）基因與乳酸乳球菌（ pNZ8148）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收，再經(jīng) T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 MC1061 感受態(tài)細(xì)胞中；

（3）使用氯霉素抗性進(jìn)行篩選后，提取重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZ9000中，PCR 鑒定正確，得到重組乳酸乳酸球菌 Lysostaphin-pNZ8148-NZ9000；

（4）Western Blot鑒定重組乳酸乳球菌的表達(dá)結(jié)果。

一種表達(dá)溶葡球菌素基因的重組乳酸乳球菌的應(yīng)用，所述的重組

乳酸乳球菌Lysostaphin-pNZ8148-NZ9000全培養(yǎng)基可直接飼喂動(dòng)物，既可發(fā)揮乳酸乳球菌的益生菌功效，又可發(fā)揮豬溶葡球菌素殺滅腸道內(nèi)葡萄球菌，預(yù)防和治療葡萄球菌病的功效。

實(shí)施例 1

目的基因的合成