[發明專利]一種重組短短芽孢桿菌的構建方法

在審

• 申請號: 201710467689.2
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN109055418A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 曹遠東;曾二生;潘烘;周志;張燕
• 申請（專利權）人: 江西嘉博生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/27;C12N15/66;C12N1/21
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 謝德珍

一種重組短短芽孢桿菌的構建方法，包括以下步驟：首先合成豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Porcine GM?CSF）基因與短短芽孢桿菌（pNY326）質粒；再用BamHI和EcoRI分別對Porcine GM?CSF基因和pNY326質粒進行雙酶切，于37℃溫箱反應3h；使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收Porcine GM?CSF基因和pNY326質粒的酶切產物，并將回收的雙酶切產物進行4℃過夜連接反應；將連接反應產物直接電轉化短短芽孢桿菌SP3，電轉完成后進行30℃搖床80rpm緩慢復蘇1h；將復蘇好的轉化產物用新霉素抗性篩選轉化子，獲得重組短短芽孢桿菌。本發明可快速、簡便的獲得豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。

技術領域

本發明涉及一種重組短短芽孢桿菌的構建方法。

背景技術

短短芽孢桿菌是一種安全、無毒性的益生菌，同時具有蛋白分泌能力強和胞外蛋白酶活性低的特點，因此特別適合做為胞外分泌蛋白表達系統。

集落刺激因子（CSF）是一組在體內外均能刺激骨髓造血干細胞分化成細胞集落的低分子細胞因子。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子可刺激前粒細胞單核細胞分化生成粒細胞和單核細胞。集落刺激因子是機體最重要的細胞因子之一，在免疫細胞分化過程中發揮重要作用，可做為免疫增強佐劑以增強疫苗的免疫原性，本發明合成了豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因，并與質粒pNY326構建了重組質粒，成功電轉化短短芽孢桿菌SP3，獲得了表達豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組短短芽孢桿菌，重組豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的高效表達為其做為豬用疫苗免疫增強劑的廣泛使用奠定了基礎。

發明內容

本發明其目的就在于提供一種重組短短芽孢桿菌的構建方法，具有快速、簡便的獲得豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的特點。

為實現上述目的而采取的技術方案是，一種重組短短芽孢桿菌的構建方法，包括以下步驟：

（1）合成豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Porcine GM-CSF）基因與短短芽孢桿菌（pNY326）質粒；

（2）用BamHI和EcoRI分別對Porcine GM-CSF基因和pNY326質粒進行雙酶切，于37℃溫箱反應3h；

（3）使用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳回收Porcine GM-CSF基因和pNY326質粒的酶切產物，并將回收的雙酶切產物進行4℃過夜連接反應；

（4）將連接反應產物直接電轉化短短芽孢桿菌SP3，電轉完成后進行30℃搖床80rpm緩慢復蘇1h；

（5）將復蘇好的轉化產物用新霉素抗性篩選轉化子，獲得重組短短芽孢桿菌。

有益效果

與現有技術相比本發明具有以下優點。

本發明可快速、簡便的獲得豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。

附圖說明

以下結合附圖對本發明作進一步詳述。

圖1為本發明中Porcine GM-CSF-pNY326重組質粒的PCR鑒定圖；

圖2為本發明中短短芽孢桿菌為SP3表達Porcine GM-CSF純化蛋白的western blot圖；

圖3為本發明中pNY326質粒圖譜；

圖4為本發明中pNY326質粒的多克隆位點圖譜。

具體實施方式

一種重組短短芽孢桿菌的構建方法，如圖1-4所示，包括以下步驟：

（1）合成豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Porcine GM-CSF）基因與短短芽孢桿菌（pNY326）質粒；