[發明專利]利用Glycosylasparaginase酶釋放及純化制備還原性N?糖鏈的方法

在審

• 申請號: 201710466217.5
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN107384987A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 王仲孚;黃琳娟;張英;宋晶晶
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P21/06;C08B37/00;C08B37/02
• 代理公司: 西安智萃知識產權代理有限公司61221
• 代理人: 李炳輝

技術領域

本發明屬于糖生物學技術領域，具體涉及一種利用Glycosylasparaginase酶釋放及純 化制備還原性N-糖鏈的方法及該方法的用途。

背景技術

生物體中50％以上的蛋白質以糖蛋白的形式存在，糖蛋白在動物、植物、細菌、真 菌中廣泛存在。糖基化是蛋白質翻譯后修飾中最主要的修飾之一，在蛋白質翻譯調控、 蛋白質降解等過程中起著非常重要的作用。

在真核生物中，糖蛋白分類是基于糖鏈與蛋白質的連接類型的，可分為：N-糖鏈和 O-糖鏈兩大類。其中，糖蛋白的O-糖鏈是通過N-乙酰葡萄糖胺連接在蛋白質絲氨酸或絲 氨酸的羥基氧上，也有通過O-甘露醇等其他方式的連接。糖蛋白的N-糖鏈與蛋白質中的 天冬酰胺殘基(Asn)的氨基側鏈共價相連，在動物細胞中，幾乎都是N-乙酰葡萄糖胺 與Asn殘基以β-苷鍵構型相連。N-糖鏈不僅介導細胞之間的識別以及信號轉導過程，還 在蛋白質的穩定性、定位以及受體之間的相互作用中具有重要的生物學功能和意義 Weixuan Chen；et al.Journal of Proteome Research,(2014),13(3):1466-1473。

在植物和昆蟲中N-糖鏈普遍存在α-1,3-巖藻糖(Fucose，簡稱Fuc)修飾。研究表 明，由于植物中糖鏈的這種特殊結構修飾，將植物糖蛋白注入到人體會產生免疫交叉反 應，即引起過敏反應，Wei Song；et al.Journal of Proteomics,(2011),74(8):1463-1474。樹 木花粉、蜂毒等都是主要的過敏原，而且通常與食物引起的過敏反應息息相關，但是有 關這些物質寡糖結構的分析報道較少，Wei Song；et al.Journal of Proteomics,(2011),74(8): 1463-1474。主要是由于缺乏對這類N-糖鏈的特異性、高效的分析方法和手段。

由于完整的糖蛋白分子量較大，很難直接對其中的N-糖鏈進行分析。因此，一般需 要將N-糖鏈從蛋白上釋放下來，才能進行下一步的分析檢測，因此，糖鏈的釋放在糖鏈 分析中是一個非常關鍵的環節，對糖蛋白糖鏈結構和功能的分析研究有重要意義。由于 生物體內N-糖鏈表達的微量性和復雜性，同時又具有多羥基，一般需對糖鏈進行化學衍 生以改變其疏水性，便于后續多重分析模式和方法，如高效液相色譜(HPLC)，質譜 (MS)和毛細管電泳(CE)等進行高效的分析。因而高效獲取還原性N-糖鏈對糖類物 質進行后續的結構和功能研究尤為重要。

目前，糖蛋白N-糖鏈的釋放主要采用特異性酶解法和化學法。常見的化學法有肼解 法，即糖蛋白在無水肼中于90℃反應4h可以非還原性的釋放糖鏈，此方法雖通用性好， 但是無水肼有劇毒，容易爆炸，且反應過程中，N-乙酰氨基中的酰基易脫落。糖蛋白還 可以在氫氧化鈉(NaOH)和硼氫化鈉(NaBH₄)體系中進行解離，糖蛋白在氫氧化鈉 堿性介質中能解離出還原性N-糖鏈，由于脫乙酰化副反應十分嚴重，并且還原性糖鏈在 強堿性的水性介質中會發生降解，在反應體系中加入硼氫化鈉等還原劑，使得解離下來 的糖鏈主要生成還原端為醇羥基的糖醇產物，該產物不可進行熒光標記，不利于后續的 分離分析。糖蛋白在濃氨水和飽和的碳酸鈉中釋放還原性N-糖鏈的方法，水解后一部分 核心α-1,3-巖藻糖(α-1,3-Fuc)糖基化還原性N-糖鏈在堿性環境下會發生peeling降解，不 利于后續的分析。