[發明專利]利用Glycosylasparaginase酶釋放及純化制備還原性N?糖鏈的方法

在審

• 申請號: 201710466217.5
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN107384987A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 王仲孚;黃琳娟;張英;宋晶晶
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P21/06;C08B37/00;C08B37/02
• 代理公司: 西安智萃知識產權代理有限公司61221
• 代理人: 李炳輝

1.利用Glycosylasparaginase酶釋放還原性N-糖鏈的方法，其包括以下步驟：

(a)向變性處理后的糖蛋白樣品中加入Tris-HCl緩沖液，溶解樣品，然后加入適量的胰蛋白酶，在適宜條件下進行酶解反應，得到含有N-糖肽的酶解液，終止胰蛋白酶的反應，冷卻至室溫；

(b)向步驟(a)所得到的含有N-糖肽的酶解液中加入適量的Glycosylasparaginase酶，合適條件下進行酶解反應，得到還原性N-糖鏈。

2.根據權利要求1所述的利用Glycosylasparaginase酶釋放還原性N-糖鏈的方法，其特征在于，所述步驟(a)具體過程為：向變性處理后的糖蛋白樣品中加入pH為8，含有1.0mM氯化鈣的Tris-HCl緩沖液，至完全溶解樣品；

然后向其中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的用量為：胰蛋白酶與蛋白樣品的質量比為1：40～200；

將所得混合物置于37℃恒溫水浴中，反應12小時，得到含有N-糖肽的酶解液；

將酶解液置于100℃條件下，反應3分鐘，終止胰蛋白酶的反應，并冷卻至室溫。

3.根據權利要求1所述的利用Glycosylasparaginase酶釋放還原性N-糖鏈的方法，其特征在于：所述步驟(b)具體過程為：向步驟(a)所得到的酶解液中加入Glycosylasparaginase酶，所述Glycosylasparaginase酶的含量為750unit/100μL，Glycosylasparaginase酶的用量為：每1μL酶液作用于2mg～10mg蛋白樣品；

然后所得混合物體系置于37℃恒溫條件下，反應12小時～24小時，得到還原性N-糖鏈粗品。

4.根據權利要求1所述的利用Glycosylasparaginase酶釋放還原性N-糖鏈的方法，其特征在于：步驟(a)中所述的Tris-HCl緩沖液為pH為8，含有1.0mM氯化鈣的0.1M的Tris-HCl緩沖液。

5.權利要求1～4任一項所述的方法釋放得到的還原性N-糖鏈的純化方法，其特征在于：將酶解法釋放得到還原性N-糖鏈粗品，依次經微晶纖維素柱純化和石墨碳固相萃取柱純化，以除去雜質和鹽，得到純化后的還原性N-糖鏈樣品。

6.權利要求1～4任一項所述的利用Glycosylasparaginase酶釋放還原性N-糖鏈的方法用于釋放所有類型還原性N-糖鏈的用途，其特征在于：所述所有類型還原性N-糖鏈包括核心α-1,3-Fuc修飾的N-糖鏈。

7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶釋放后得到的所述還原性N-糖鏈為末端帶有半縮醛羥基的N-糖鏈。

8.根據權利要求6所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶釋放得到的還原性N-糖鏈的類型有以下三種：高甘露糖型、復雜型和雜合型，N-糖鏈模式如下所示：

(1)高甘露糖型N-糖鏈模式：

(2)復雜型N-糖鏈模式：

(3)雜合型N-糖鏈模式：

9.根據權利要求6所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶釋放所有類型還原性N-糖鏈時，可對一般類型還原性N-糖鏈和核心α-1,3-Fuc修飾還原性N-糖鏈同時進行釋放。

10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶釋放的所有類型還原性N-糖鏈的結構類型如下所示：

(1)一般類型還原性N-糖鏈

(2)植物或昆蟲中α-1,3-Fuc和β-1,2木糖(Xylose，Xyl)修飾的還原性N-糖鏈