[發明專利]一種檢測嵌合抗原受體或基因修飾的T細胞受體表達的方法和應用

有效

• 申請號: 201710464896.2
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN107254489B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 韋丹;付蘇雷;連杰;趙禮軍;李德志
• 申請（專利權）人: 河南省華隆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C07K14/705;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明涉及免疫學和分子生物學領域，具體涉及一種檢測嵌合抗原受體或基因修飾的T細胞受體表達的方法和應用，所述方法主要包括以下步驟：(1)將包裝好的CAR或TCR慢病毒侵染貼壁細胞或懸浮細胞，獲得表達CAR或TCR的穩定轉染貼壁細胞或懸浮細胞；(2)將貼壁細胞鋪板，待貼壁細胞的融合度達到70?90％時，加入相應的懸浮細胞；(3)繼續培養并收集上清，對懸浮在上清中的細胞進行計數并觀察懸浮細胞與貼壁細胞結合現象。本發明的檢測嵌合抗原受體或基因修飾的T細胞受體表達的方法不但能判定CAR或TCR是否正確表達，還能證明已表達的CAR或TCR能否與相應的腫瘤抗原特異性結合，進一步提高了CAR或TCR表達檢測的準確率，為腫瘤免疫治療提供進一步的保障。

技術領域

本發明涉及免疫學和分子生物學領域，具體涉及一種檢測受體正確表達的方法，尤其涉及一種檢測嵌合抗原受體或基因修飾的T細胞受體表達的方法和應用。

背景技術

腫瘤的免疫療法分為兩大類：一種是解除腫瘤對免疫的耐受或屏蔽作用，讓免疫細胞重新“認識”腫瘤細胞，然后對腫瘤發起攻擊，例如PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體等；另一種是把腫瘤的特征“告訴”免疫細胞，隨后免疫細胞進行搜索定位，殺傷腫瘤，例如嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T)、T細胞受體基因修飾的T細胞(TCR-T)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、腫瘤抗原負載的樹突狀細胞誘導的特異性細胞毒性T淋巴細胞(DC-CTL)等。

其中，嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T)和T細胞受體基因修飾的T細胞(TCR-T)是當今過繼性細胞治療(ACT)療法中的兩大最新技術，發展非常迅速，已經實現了從基礎免疫學機制研究到臨床免疫治療應用的轉換。上述兩種技術的共同點是通過基因改造的手段提高T細胞對特異性癌細胞抗原的識別和進攻能力，因此統稱為“T細胞受體重新定向”技術(Tcell receptor redirection)。

T細胞通過與腫瘤細胞的接觸識別殺傷腫瘤細胞，因此嵌合抗原受體(CAR)和T細胞受體(TCR)基因在T細胞表面的正確表達無疑具有重要的位置。目前，對CAR或TCR是否表達的方法主要有兩種：一種是用PCR檢測CAR或TCR序列中的特異性基因，另一種是用流式細胞術檢測CAR或TCR結構中的特定片段(如Fab片段等)。

CN 106119411 A公開了一種CAR-T細胞病毒感染效率的檢測方法，包括如下步驟：將病毒侵染CAR-T細胞；待細胞穩定表達，抽提CAR-T細胞的全基因組DNA；運用熒光定量PCR技術檢測整合到全基因組DNA中的病毒拷貝數；數據處理：按Poisson分布規律，計算該病毒的感染效率；其中感染效率公式：P(K)＝1-P(0)；其中，P(0)＝e-m；e為自然常數；m為MOI值，即感染復數。該方法雖然能計算病毒感染的效率，但上述兩種方法都不能證明已經表達的CAR或TCR能否與相應的腫瘤抗原特異性結合，對于腫瘤的實際殺傷效力并不能準確預測。

因此，如何準確檢測嵌合抗原受體或基因修飾的T細胞受體的表達就顯得尤為重要。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種檢測嵌合抗原受體或基因修飾的T細胞受體表達的方法和應用，不但能判定CAR或TCR是否正確表達，還能證明已表達的CAR或TCR能否與相應的腫瘤抗原特異性結合。

為達此目的，本發明采用了以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種檢測CAR或TCR表達的方法，包括以下步驟：

(1)將包裝好的CAR或TCR慢病毒侵染貼壁細胞或懸浮細胞，獲得表達CAR或TCR的穩定轉染貼壁細胞或懸浮細胞；

(2)將貼壁細胞鋪板，待貼壁細胞的融合度達到70-90％時，加入懸浮細胞；

(3)繼續培養并收集上清，對懸浮在上清中的細胞進行計數并觀察懸浮細胞與貼壁細胞結合現象；