[發(fā)明專利]一種檢測(cè)嵌合抗原受體或基因修飾的T細(xì)胞受體表達(dá)的方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710464896.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN107254489B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋丹;付蘇雷;連杰;趙禮軍;李德志
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省華隆生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C07K14/705;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種檢測(cè)嵌合抗原受體或基因修飾的T細(xì)胞受體表達(dá)的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將包裝好的CAR或TCR慢病毒侵染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，獲得表達(dá)CAR或TCR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；

(2)將貼壁細(xì)胞鋪板，待貼壁細(xì)胞的融合度達(dá)到70-90％時(shí)，加入懸浮細(xì)胞；

(3)繼續(xù)培養(yǎng)并收集上清，對(duì)懸浮在上清中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并觀察懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞結(jié)合現(xiàn)象；

其中，當(dāng)CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)于懸浮細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為步驟(1)所述的表達(dá)CAR或TCR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)的懸浮細(xì)胞；

當(dāng)CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)于貼壁細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為步驟(1)所述的表達(dá)CAR或TCR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞；

步驟(2)所述鋪板為將貼壁細(xì)胞鋪于酶標(biāo)板中，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)；

所述酶標(biāo)板中貼壁細(xì)胞的數(shù)量為(3-8)×10⁵個(gè)/孔；

所述培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清的混合溶液；

所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶標(biāo)板為6孔酶標(biāo)板、12孔酶標(biāo)板或24孔酶標(biāo)板中的任意一種或至少兩種的組合。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶標(biāo)板為6孔酶標(biāo)板；

所述酶標(biāo)板中貼壁細(xì)胞的數(shù)量為5×10⁵個(gè)/孔；

所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8-12％。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的條件為CO₂濃度為3-10％；

所述培養(yǎng)的溫度為30-42℃。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的條件為CO₂濃度為5-7％；

所述培養(yǎng)的溫度為35-40℃。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的溫度為37℃。

8.如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述懸浮細(xì)胞的加入量為(0.5-3)×10⁶個(gè)/孔；

所述貼壁細(xì)胞的融合度為75-85％。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述懸浮細(xì)胞的加入量為1×10⁶個(gè)/孔；

所述貼壁細(xì)胞的融合度為80％。

10.如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基與胎牛血清的混合溶液；

所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8-12％。

12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％。

13.如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為6-7h。

14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為6h。

15.如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述計(jì)數(shù)為用血球計(jì)數(shù)板和/或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

16.如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)用包裝好的CAR或TCR的慢病毒侵染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，獲得表達(dá)CAR或TCR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；

(2)將貼壁細(xì)胞在六孔酶標(biāo)板上進(jìn)行鋪板，數(shù)量為(3-8)×10⁵個(gè)/孔，加入DMEM培養(yǎng)基與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％胎牛血清，在CO₂濃度3-10％、溫度30-42℃條件下培養(yǎng)；

當(dāng)貼壁細(xì)胞的融合度達(dá)到70-90％時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入(0.5-3)×10⁶個(gè)/孔的懸浮細(xì)胞的1640培養(yǎng)基與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％胎牛血清；

(4)繼續(xù)培養(yǎng)6-7h并收集上清，對(duì)上清中的細(xì)胞采用血球計(jì)數(shù)板和/或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)；

當(dāng)CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)于懸浮細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為步驟(1)所述的表達(dá)CAR或TCR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)的懸浮細(xì)胞；當(dāng)CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)于貼壁細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為CAR或TCR靶向的腫瘤抗原表達(dá)的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為步驟(1)所述的CAR或TCR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞。