[發明專利]一種基于質譜的N-糖鏈相對定量的方法

有效

• 申請號: 201710460611.8
• 申請日: 2017-06-18
• 公開（公告）號: CN109142506B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 陸豪杰;張瑩;楊麗君
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N27/64
• 分類號: G01N27/64;G01N1/38;G01N1/42
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬生化分析技術領域，涉及一種基于質譜的N?糖鏈相對定量的方法，本方法利用苯胺功能化的大環化合物標記N?糖鏈再螯合稀土金屬離子相對定量，其中采用苯胺功能化的DOTA對N?糖鏈衍生，在螯合稀土金屬離子Ho³⁺/Lu³⁺，兩步反應均具有較高的衍生效率；測試結果顯示，通過衍生上螯合了稀土金屬離子的DOTA后，能提高糖鏈在MALDI?MS負離子反射模式下的離子化效率，并改善糖鏈在質譜中的碎裂，有助于糖鏈結構解析。本發明用于大腸癌病人與正常人血清中N?糖鏈表達水平的差異分析結果顯示，本方法通過螯合不同的稀土金屬離子，能實現多標標記定量，并具有很好的定量準確性及重復性。

技術領域

本發明屬生化分析技術領域，涉及N-糖組學分析，具體涉及一種基于質譜的N-糖鏈相對定量的方法，尤其涉及一種利用苯胺功能化的大環化合物標記N-糖鏈再螯合稀土金屬離子的相對定量新方法。本方法通過衍生上螯合了稀土金屬離子的DOTA后，能提高糖鏈在MALDI-MS負離子反射模式下的離子化效率，并改善糖鏈在質譜中的碎裂，有助于糖鏈結構解析；通過螯合不同的稀土金屬離子，能實現多標標記定量，并具有很好的定量準確性及重復性。

背景技術

現有技術公開了N-糖基化是生物體內最普遍存在的一種翻譯后修飾，在諸多生命過程中起著重要的作用，如蛋白質的折疊，細胞-細胞相互作用，細胞識別以及炎癥反應等。研究表明，異常的糖基化與許多重大疾病，如免疫缺陷，老年癡呆癥及癌癥等息息相關。研究報道，N-糖鏈有可能成為癌癥的血清標志物，因此，解析N-糖鏈結構并進一步定量分析是深入了解N-糖鏈在生物過程所扮演角色的必要前提，然而，實踐顯示，所述的研究面臨著巨大的困難，首先，含糖基化修飾的蛋白種類雖然很多，但是其豐度很低，第二，由于N-糖鏈是非模板合成，具有微觀不均一性，且離子化效率低，在質譜解析上仍存在著諸多瓶頸，第三，盡管已經有較多的方法實現了N-糖鏈的定量，如代謝標記，¹⁸O標記，化學標記等，但該些定量方法仍存在下述缺陷，均為基于同位素²D,¹³C,¹⁵N和¹⁸O的標記實現質量差標簽的引入，等?；诂F有技術的現狀，本申請的發明人擬提供一種基于稀土金屬離子螯合標記的偽同位素標記方法，尤其涉及一種利用苯胺功能化的大環化合物標記N-糖鏈再螯合稀土金屬離子的相對定量新方法；通過苯胺功能化的DOTA(S-2-(4-氨基芐基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷四乙酸)標記N-糖鏈的還原端，再螯合不同的稀土金屬離子，使能夠同時實現N-糖鏈的結構解析及相對定量。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的缺陷，提供一種基于質譜的N-糖鏈相對定量的方法，具體涉及一種利用苯胺功能化的大環化合物標記N-糖鏈再螯合稀土金屬離子的相對定量新方法。尤其是一種利用苯胺功能化的DOTA標記N-糖鏈還原端再螯合稀土金屬離子Ho³⁺/Lu³⁺實現相對定量的方法。本方法有助于N-糖鏈結構解析并實現N-糖鏈相對定量。

為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：

1.以麥芽七糖DP7為標準樣品，考察苯胺功能化的DOTA與糖鏈的衍生效率；

2.考察苯胺功能化的DOTA螯合稀土金屬離子Ho³⁺/Lu³⁺的衍生效率；

3.以麥芽七糖DP7為標準樣品，考察DOTA螯合稀土金屬離子Ho³⁺/Lu³⁺標記糖鏈用于糖鏈相對定量的可行性；

4.以核糖核酸酶B(RNB)、去唾液酸胎球蛋白(ASF)、雞卵清白蛋白(OVA)、牛血清胎球蛋白(Fetuin)為標準糖蛋白，測試DOTA螯合稀土金屬離子Ho³⁺/Lu³⁺標記N-糖鏈用于N-糖鏈相對定量的可行性；