[發(fā)明專利]一種細胞凍存方法及細胞凍存液

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710460512.X
• 申請日: 2017-06-18
• 公開（公告）號: CN107258766A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設計）人: 張和平;盧永波
• 申請（專利權）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種細胞凍存方法，其特征在于，所述細胞凍存方法包括以下兩個步驟：

步驟一、將混入細胞的細胞凍存液裝入容器1，再將所述容器1裝入容器2，其中，所述容器1和所述容器2之間形成真空；

步驟二、對步驟一所得的所述容器2依此執(zhí)行以下A-D四個步驟：

A、利用常溫風冷使所述容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降3-4℃；

B、利用冰箱使所述容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1-2℃；

C、利用冰箱使所述容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2-3℃；

D、將所述容器2放入液氮罐中凍存，其中，所述液氮罐的溫度為-196℃。

2.根據(jù)權利要求1所述的細胞凍存方法，其特征在于，所述步驟二具體包括：對步驟一所得的所述容器2依此執(zhí)行以下A-D四個步驟：

A、利用常溫風冷使所述容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降4℃；

B、利用冰箱使所述容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1℃；

C、利用冰箱使所述容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2℃；

D、將所述容器2放入液氮罐中凍存，其中，所述液氮罐的溫度為-196℃。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的細胞凍存方法，其特征在于，所述細胞為表皮干細胞、成纖維細胞、角膜細胞、脂肪干細胞、黑色素細胞、口腔黏膜上皮細胞或者口腔牙齦細胞。

4.根據(jù)權利要求3所述的細胞凍存方法，其特征在于，所述細胞為第2~7代的細胞。

5.一種細胞凍存液，其特征在于，所述細胞凍存液應用于如權利要求1-4中任意一項所述的細胞凍存方法，所述細胞凍存液包括：DMEM/F12、DMSO、甘油和血清替代物；

其中，所述DMSO在所述細胞凍存液中的含量為2-10%的所述DMEM/F12的體積；所述甘油在所述細胞凍存液中的含量為5-30%的所述DMEM/F12的體積；所述血清替代物在所述細胞凍存液中的含量為20-60%的所述DMEM/F12的體積；

所述血清替代物包括羥乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重組人轉鐵蛋白、人AB血清、表皮生長因子、重組人胰島素、孕酮、氫化可的松、腐胺、硒酸鈉和黃酮。

6.根據(jù)權利要求5所述的細胞凍存液，其特征在于，所述羥乙基淀粉的濃度為0.1-10%W/V，所述葡聚糖的濃度為0.1-10%W/V，所述人血白蛋白的濃度為0.1-15%W/V，所述重組人轉鐵蛋白的濃度為1-10%W/V，所述人AB血清的濃度為1-10%W/V，所述表皮生長因子的濃度為0.01-10%W/V，所述重組人胰島素的濃度為1-10%W/V，所述孕酮的濃度為0.01-5%W/V，所述氫化可的松的濃度為0.01-5%W/V，所述腐胺的濃度為0.01-5%W/V，所述硒酸鈉的濃度為0.1-5%W/V，所述黃酮的濃度為0.01-5%W/V。

7.根據(jù)權利要求5或6所述的細胞凍存液，其特征在于，所述甘油在所述細胞凍存液中的含量為10-25%的所述DMEM/F12的體積。

8.根據(jù)權利要求5或6所述的細胞凍存液，其特征在于，所述血清替代物在所述細胞凍存液中的含量為30-40%的所述DMEM/F12的體積。

9.根據(jù)權利要求5或6所述的細胞凍存液，其特征在于，所述DMEM/F12是DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液以體積比3:1的比例混合的。