[發(fā)明專(zhuān)利]一種細(xì)胞凍存方法及細(xì)胞凍存液

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710460512.X
• 申請(qǐng)日: 2017-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107258766A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張和平;盧永波
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A01N1/02
• 分類(lèi)號(hào): A01N1/02
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞凍存方法及細(xì)胞凍存液。

背景技術(shù)

超低溫冷凍保存是細(xì)胞長(zhǎng)期保存的一種有效方法，主要通過(guò)降低細(xì)胞的代謝率來(lái)起到保護(hù)作用。液氮(-196℃)保存細(xì)胞是最常見(jiàn)的一種細(xì)胞長(zhǎng)期保存方式，調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的各類(lèi)酶的作用受到極大抑制，使細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)十分緩慢，甚至停止，從而避免細(xì)胞遺傳性狀的改變，細(xì)胞和組織不會(huì)喪失形態(tài)發(fā)生的潛能。但是，凍傷是超低溫保護(hù)最大的負(fù)反應(yīng)，其原因是冰晶所致的機(jī)械性損傷和滲透性損傷。目前細(xì)胞凍存主要是快速凍存法，即玻璃化法。但是如果沒(méi)有采取合適的凍存方法和合適的冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞在凍存過(guò)程中容易被凍傷。改進(jìn)凍存液和凍存方法是改進(jìn)保存細(xì)胞的重要途徑，目前很多研究都是改進(jìn)凍存液和凍存方法來(lái)保護(hù)細(xì)胞盡量免受凍存過(guò)程凍傷的情況。

目前絕大多數(shù)凍存液中含有動(dòng)物源性的血清成分，而動(dòng)物源性血清存在傳染病毒的風(fēng)險(xiǎn)；因動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致，影響每批試驗(yàn)或生產(chǎn)結(jié)果；血清成本很高，加重了生產(chǎn)成本。因此，不含血清的細(xì)胞凍存液是將來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)，有些單位或機(jī)構(gòu)研究無(wú)血清細(xì)胞凍存液。申請(qǐng)?zhí)朇N201610322202.7的專(zhuān)利公開(kāi)了一種無(wú)血清細(xì)胞凍存液，用于解決凍存液使用不方便、成本高、細(xì)胞存活率低的問(wèn)題。申請(qǐng)?zhí)朇N201610124499.6的專(zhuān)利公開(kāi)了一種人脂肪干細(xì)胞無(wú)血清凍存液及其制備方法。

現(xiàn)有無(wú)血清的凍存液長(zhǎng)期冷凍后解凍，細(xì)胞復(fù)蘇率低，復(fù)蘇后細(xì)胞活性與性能下降，而且無(wú)法滿(mǎn)足不同細(xì)胞長(zhǎng)期凍存的需要。

目前大多數(shù)凍存液中含有動(dòng)物源性的血清成分，而動(dòng)物源性血清存在傳染病毒的風(fēng)險(xiǎn)；因動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致，影響每批試驗(yàn)或生產(chǎn)結(jié)果；含血清后后期的產(chǎn)品安全檢驗(yàn)成本會(huì)很高，加重了生產(chǎn)成本。盡管目前玻璃化凍存是比較理想的凍存方法，但是它在玻璃化過(guò)程還是會(huì)形成冰晶損傷細(xì)胞，而且復(fù)蘇后細(xì)胞活率低、細(xì)胞增殖數(shù)量不足、細(xì)胞易老化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種細(xì)胞凍存方法及細(xì)胞凍存液，由于該細(xì)胞凍存液中不含血清，能夠提高細(xì)胞復(fù)蘇率，使細(xì)胞復(fù)蘇后活性與性能高、可滿(mǎn)足多種不同細(xì)胞長(zhǎng)期凍存的需要。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明實(shí)施例采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明實(shí)施例提供一種細(xì)胞凍存方法，細(xì)胞凍存方法包括以下兩個(gè)步驟：

步驟一、將混入細(xì)胞的細(xì)胞凍存液裝入容器1，再將容器1裝入容器2，其中，容器1和容器2之間形成真空；

步驟二、對(duì)步驟一所得的容器2依此執(zhí)行以下A-D四個(gè)步驟：

A、利用常溫風(fēng)冷使容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降3-4℃；

B、利用冰箱使容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1-2℃；

C、利用冰箱使容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2-3℃；

D、將容器2放入液氮罐中凍存，其中，液氮罐的溫度為-196℃。

進(jìn)一步地，步驟二具體包括：對(duì)步驟一所得的容器2依此執(zhí)行以下A-D四個(gè)步驟：

A、利用常溫風(fēng)冷使容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降4℃；

B、利用冰箱使容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1℃；

C、利用冰箱使容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2℃；

D、將容器2放入液氮罐中凍存，其中，液氮罐的溫度為-196℃。

進(jìn)一步地，細(xì)胞為表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角膜細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、口腔黏膜上皮細(xì)胞或者口腔牙齦細(xì)胞。

進(jìn)一步地，細(xì)胞為第2~7代的細(xì)胞。

本發(fā)明實(shí)施例還提供一種細(xì)胞凍存液，細(xì)胞凍存液應(yīng)用于如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的細(xì)胞凍存方法，細(xì)胞凍存液包括：DMEM/F12、DMSO、甘油和血清替代物；

其中，DMSO在細(xì)胞凍存液中的含量為2-10%的DMEM/F12的體積；甘油在細(xì)胞凍存液中的含量為5-30%的DMEM/F12的體積；血清替代物在細(xì)胞凍存液中的含量為20-60%的DMEM/F12的體積；

血清替代物包括羥乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人AB血清、表皮生長(zhǎng)因子、重組人胰島素、孕酮、氫化可的松、腐胺、硒酸鈉和黃酮。