[發(fā)明專利]角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基及制備方法和使用方法

有效

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• 申請日: 2017-06-18
• 公開（公告）號: CN107164306B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設計）人: 何欣;李瀟;盧永波
• 申請（專利權）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基及制備方法和使用方法，所述固體培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基和瓊脂糖水溶液按照1:1的體積比混合均勻后凝固制成；所述瓊脂糖水溶液的質(zhì)量濃度為0.5%～5%；所述基礎培養(yǎng)基以DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液的混合溶液為基礎液，添加胎牛血清、維甲酸、人表皮生長因子、胰島素、氫化可的松、腺嘌呤、三碘甲狀腺氨酸、谷氨酰胺和低溫保護劑；所述低溫保護劑為HEPES、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、維生素E、維生素C、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素的混合物。本發(fā)明的固體培養(yǎng)基具有減少組織細胞低溫缺氧損傷的優(yōu)點，能夠有效保證角膜模型測試結果的準確性，同時方便操作及長途運輸。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，具體涉及一種角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基及制備方法和使用方法。

背景技術

隨著體外器官培養(yǎng)技術的發(fā)展，基于體外細胞培養(yǎng)構建的3D重組角膜上皮模型，在眼刺激風險評價領域表現(xiàn)出特有的趨勢。體外構建的3D角膜上皮模型類似于人體角膜上皮的細胞三維結構，不僅可以更為真實的反映人體對化學物的響應，準確給出化學物刺激性的預測，對于化合物篩選的種類也具有更寬的應用范疇，除了不同功效目的的劑型開發(fā)，也包括化妝品具體成分的危害評價。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）已通過角膜模型EpiOcular的驗證和相應的測試法案。

由于體外3D角膜模型的自身特點，要求能夠在體外保持其結構和活性，從而確保測試結果的準確性，因此模型的應用受到其保存運輸條件的制約，同時還應最大限度地排除外來化學物的影響。因此開發(fā)一種適合體外重建3D角膜模型保存運輸?shù)呐囵B(yǎng)基意義重大。

目前臨床上角膜保存方法多樣，包括短期保存、中期保存、中長期保存、長期保存、非活性保存等。其中，短期保存法即濕房保存，是將全眼球消毒處理后在濕房內(nèi)4℃保存，仍是許多眼庫運用最多的角膜短期保存方法。優(yōu)點是簡便、經(jīng)濟，但受保存時間限制，一般只能保存24~48h。中期保存液保存是用活性保存液4℃低溫條件下使角膜活性保持4~14d，以至更長時間的方法。1973年美國McCary和Kaufman發(fā)明了第一代角膜保存液，即MK液，開創(chuàng)了角膜中期保存的先河。其方法簡單、經(jīng)濟，效果可靠，但保存時間有限，一般認為4d以內(nèi)效果最佳。隨后許多學者在MK液基礎上進行改進，加入硫酸軟骨素和HEPES緩沖系統(tǒng)，經(jīng)過改進，角膜保存液可有效保存10~14d，其代表是K-sol，CSM，Dexsol液。1990年Kaufman和Lindstrom研制出新一代Optisol角膜中期保存液，是目前公認的較理想的保存液。中長期保存即器官培養(yǎng)是用模擬角膜生理環(huán)境的組織培養(yǎng)液，在近似角膜生理溫度條件下30~37℃提供角膜必需的營養(yǎng)和條件來保存角膜，能較好地維持角膜的代謝，有利于角膜創(chuàng)傷修復，確保活性達4~5周。使用器官培養(yǎng)液的一個缺點是保存期間角膜水腫，因此必須在角膜移植術前使角膜脫水，而角膜水腫和脫水過程中可導致角膜內(nèi)皮細胞損傷。但該方法需要在 30~37℃環(huán)境中經(jīng)常更換培養(yǎng)液，容易造成污染而致保存失敗，且對設備及檢測技術要求較高、操作復雜，目前在我國難以推廣。長期保存即深低溫保存是將角膜在冷凍劑保護下，控速降溫到-80℃，然后貯存于-196℃液氮中，待用時復溫取出，可保存1年以上。深低溫下可完全抑制細胞的能量代謝，使之呈“休眠狀態(tài)”，從而避免因代謝產(chǎn)物積聚的毒害及代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而死亡，另外還可避免微生物繁殖而使角膜受染。由于深低溫保存的角膜期限長、細胞活性接近新鮮角膜，用于穿透角膜移植術后透明率與新鮮角膜相仿且能隨時提供移植材料，是眼庫長期保存角膜的理想方法之一。但降溫操作復雜，如有不慎容易引起細胞冰晶損害，如角膜內(nèi)皮產(chǎn)生裂孔、細胞間連接斷裂、角膜內(nèi)皮大片壞死和結構改變，使細胞在復溫培養(yǎng)過程中死亡。對冷凍保護劑研究發(fā)現(xiàn)，二甲亞砜、丙二醇、硫酸軟骨素均能使角膜細胞獲得玻璃化作用，減少冰晶的發(fā)生，但必須采用穩(wěn)定的方法使角膜細胞和冷凍保護劑達到平衡。非活性保存是一種防腐保存，分為干燥保存、冷凍保存等，是通過對角膜加工處理，使角膜組織內(nèi)移去水分，阻止細胞酶失活，抑制組織細胞自溶，從而保持組織細胞的完整性。多數(shù)學者認為非活性保存材料只能用于板層角膜移植，因為板層角膜移植所需要的材料不要求內(nèi)皮細胞具有活性，只要具有完整膠原板層結構就能使用，植片移植后只能充當一個支架組織。