[發(fā)明專(zhuān)利]角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基及制備方法和使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710460502.6
• 申請(qǐng)日: 2017-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107164306B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何欣;李瀟;盧永波
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/071
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和瓊脂糖水溶液按照1:1的體積比混合均勻后凝固制成；所述瓊脂糖水溶液的質(zhì)量濃度為0.5%～5%；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液的混合溶液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清、維甲酸、人表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、氫化可的松、腺嘌呤、三碘甲狀腺氨酸、谷氨酰胺和低溫保護(hù)劑；所述DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液的混合溶液中DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液的體積比為3:（1～9），所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中胎牛血清的體積百分含量為5%～20%，維甲酸的濃度為4μg/mL～10μg/mL，人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為0.1ng/mL～10.0ng/mL，胰島素的濃度為5.0ng/mL～50.0ng/mL，氫化可的松的濃度為0.1μg/mL～10.0μg/mL，腺嘌呤的濃度為5.0μg/mL～50.0μg/mL，三碘甲狀腺氨酸的濃度為0.1μg/mL～10.0μg/mL，谷氨酰胺的濃度為0.2g/L～20.0g/L；所述低溫保護(hù)劑為HEPES、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、維生素E、維生素C、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素的混合物，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中HEPES的濃度為1mmol/L～100mmol/L，蔗糖的濃度為0.1mmol/L～50mmol/L，甘氨酸的濃度為0.1mmol/L～100mmol/L，丙氨酸的濃度為0.1mmol/L～100mmol/L，腺苷的濃度為1mmol/L～200mmol/L，維生素E的濃度為0.01mmol/L～20mmol/L，維生素C的濃度為0.01mmol/L～20mmol/L，透明質(zhì)酸的體積百分含量為0.1%～10%，硫酸軟骨素的濃度為1g/L～100g/L。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基，其特征在于， 所述瓊脂糖為低熔點(diǎn)瓊脂糖，低熔點(diǎn)瓊脂糖的成膠溫度為28℃～32℃，熔化溫度為62℃～68℃。

3.一種制備如權(quán)利要求1或2所述角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、將DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液混合均勻，然后加入胎牛血清、維甲酸、人表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、氫化可的松、腺嘌呤、三碘甲狀腺氨酸和谷氨酰胺，溶解后過(guò)濾除菌，得到角膜模型培養(yǎng)基；

步驟二、向步驟一中所述角膜模型培養(yǎng)基中加入HEPES、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、維生素E、維生素C、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素，溶解后過(guò)濾除菌，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

步驟三、將瓊脂糖用去離子水溶解后滅菌，得到瓊脂糖水溶液；

步驟四、將步驟三中所述瓊脂糖水溶液緩慢加入步驟二中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，震蕩混合均勻后加入孔板中，凝固后得到角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基。

4.一種如權(quán)利要求1或2所述角膜模型低溫保存用固體培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于，所述使用方法為：將培養(yǎng)完成的角膜模型連同外部培養(yǎng)小室嵌入固體培養(yǎng)基中，然后一同置于無(wú)菌袋中封口，4℃條件下保存；保存結(jié)束后用37℃預(yù)熱的角膜模型培養(yǎng)基對(duì)角膜模型進(jìn)行復(fù)蘇。