[發明專利]一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記及其應用

在審

• 申請號: 201710457779.3
• 申請日: 2017-06-16
• 公開（公告）號: CN107227357A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 呂少波;李蘇楊;李卓才
• 申請（專利權）人: 蘇州喬納森新材料科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 樓高潮

1.一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記，其特征在于，所述分子標記及其序列為：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記，其特征在于，所述分子標記P1、P2和P3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基T。

3.權利要求1或2所述分子標記在制備檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dNTP、LATaq、PCR反應緩沖液、MgCl₂、雙蒸水。

5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述試劑盒檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：

(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養基，形成單個菌落，向無菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數次，-20℃保存；

(2)以步驟(1)收集的菌體作為PCR模板，以P1為特異性引物，進行第一輪PCR擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋50～400倍后作為第二輪PCR的模板，以P2作為特異性引物，進行第二輪PCR擴增；

(4)取第二輪PCR擴增的產物，稀釋20～100倍后作為第三輪PCR的模板，以P3作為特異性引物，進行第三輪PCR擴增；

(5)收集第三輪PCR擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述PCR擴增的體系為25μL：模板2μL、PCR反應緩沖液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子標記1μL、雙蒸水15.5μL。

7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述第一輪PCR擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。

8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述第二輪PCR擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。

9.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述第三輪PCR擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。