[發(fā)明專(zhuān)利]蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710456565.4
• 申請(qǐng)日: 2017-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107290469B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈清;崔益瑋;李詩(shī)言;戴志遠(yuǎn)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江工商大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/88
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 杭州中成專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明公開(kāi)了一種蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法，包括如下步驟：1)、蝦夷扇貝樣品前處理，得樣品液；2)、HLB/PDMS涂層攪拌棒的制備；3)、攪拌棒吸附萃取：先將HLB/PDMS涂層攪拌棒在甲醇中浸泡，然后置入5～10mL的樣品液中，加酸調(diào)整pH值為3～7后進(jìn)行富集；然后取出HLB/PDMS涂層攪拌棒放入乙腈中進(jìn)行MCs解吸附，所得到的解吸附溶液用于液相色譜?質(zhì)譜分析；從而獲得解吸附溶液中7種微囊藻毒素的濃度，最終獲得蝦夷扇貝樣品7種微囊藻毒素的濃度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法，屬于生化分離技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用攪拌棒吸附分離蝦夷扇貝中7種微囊藻毒素并利用超高效液相色譜-質(zhì)譜分析對(duì)其定性、定量分析的方法。

背景技術(shù)

微囊藻毒素(Microcystins)為藍(lán)藻水華釋放的一類(lèi)具有強(qiáng)烈致癌作用的肝毒素，其毒性較大，分布廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體多約80余種，其結(jié)構(gòu)由7個(gè)氨基酸組成，主要產(chǎn)自微囊藻(Microcystis aeruginosa)、魚(yú)腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostocales)等浮游性藍(lán)藻，其中MC-LR最為常見(jiàn)。調(diào)查表明，我國(guó)60％的水體由于過(guò)多接納了氮和磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而出現(xiàn)了藍(lán)藻水華現(xiàn)象，該現(xiàn)象使水面湖靛堆積，大量消耗水中溶解氧致魚(yú)類(lèi)窒息死亡，藻體死亡分解過(guò)程中釋放生物毒素類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致水體污染，水生動(dòng)植物死亡。此外，已有研究證明，MCs進(jìn)入人體肝細(xì)胞后，能強(qiáng)烈地抑制蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)的活性，誘發(fā)細(xì)胞角蛋白高度磷酸化，導(dǎo)致肝細(xì)胞微絲分解、破裂和出血。因此，MCs通過(guò)食物鏈傳遞到水生動(dòng)物中，并在水生動(dòng)物體中積累富集而導(dǎo)致的人體健康潛在風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。因此建立一種淡水魚(yú)肉中高效、準(zhǔn)確、靈敏的MCs分析檢測(cè)方法，對(duì)于水產(chǎn)品的質(zhì)量安全與相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作具有著重要意義。

目前，對(duì)于各種生物體中MCs的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫(ELISA)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、液相色譜(LC)法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法等，其中LC-MS/MS方法通量較大，定性能力強(qiáng)，更適用于復(fù)雜基質(zhì)中MCs的殘留檢測(cè)。

攪拌棒吸附萃取(SBSE)是一種新型的固相微萃取樣品前處理技術(shù)，具有固定相體積大、萃取容量高、無(wú)需外加攪拌子、可避免競(jìng)爭(zhēng)性吸附、能在自身攪拌的同時(shí)實(shí)現(xiàn)萃取富集等優(yōu)點(diǎn)。目前廣泛采用的涂層為非極性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，這種涂層結(jié)構(gòu)致密，且高度疏水、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適用于水相中非極性和弱極性化合物的萃取。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏度高的蝦夷扇貝中微囊藻毒素的檢測(cè)方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1)、蝦夷扇貝樣品前處理：

①、取1g待測(cè)蝦夷扇貝肉進(jìn)行勻漿；

②、在漿液中加入10～20mL甲醇后于80±5℃超聲提取20～30min；

③、將超聲提取所得物離心(冷凍離心機(jī)離心，即，控制溫度為3～5℃)，取出上層清液；

④、以離心所得的沉淀替代步驟②中的漿液重復(fù)上述步驟②～步驟③的超聲提取和離心；

⑤、將所有的上層清液合并后用氮?dú)獯蹈桑缓笥?～10mL水復(fù)溶，得樣品液；

2)、HLB/PDMS涂層攪拌棒的制備：

①、將攪拌棒清洗后烘干；

②、配制PDMS溶膠：

將100±5μL聚二甲基硅氧烷(PDMS)、100±5μL甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、10±1μL聚甲基氫硅氧烷(PMHS)和100±5μL 95％三氟乙酸(TFA)混合，得PDMS溶膠；