[發明專利]水稻DNA損傷修復基因Osbrca1及其克隆和應用

在審

• 申請號: 201710456260.3
• 申請日: 2017-06-16
• 公開（公告）號: CN107779455A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 朱永生;鄭菲艷;許惠濱;蔡秋華;何煒;蔣家煥;連玲;鄭燕梅;張建福;謝華安
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所(普通合伙)43205
• 代理人: 許伯嚴

技術領域

本發明屬于作物遺傳育種技術領域，具體涉及為一種水稻DNA損傷修復基因Osbrca1 及其克隆和應用。

背景技術

水稻(Oryza sativa)是中國最重要的禾谷類作物之一，也是世界上重要的糧食作物，全世界超過半數的人口以稻米為主食。水稻的基因組DNA在正常條件下是穩定的，但是當遇到一些逆境脅迫條件時(如化學誘變劑、射線、微生物毒素、以及自身代謝過程中產生的活性氧自由基等)，其DNA容易遭受傷害。DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此，維護DNA分子的完整性和穩定性對生物的細胞健康發育至關緊要。如果DNA 發生諸如堿基突變、錯配、插入或缺失、嘧啶聯合、DNA加合物、DNA雙鏈斷裂、甲基化損傷、DNA鏈內和鏈間交聯等的突變時，這些受損傷的DNA會對生物體的細胞產生遺傳毒性或細胞毒性，最終導致水稻出現感病、早衰等不利于其生長發育的表型。植物在生長發育過程中常常會因為環境或DNA復制時發生突變，但通常情況下，植物都能夠正常生長。這是因為植物在漫長的進化過程中獲得了一套完整的DNA損傷修復系統，能夠及時地完成其損傷DNA的修復，從而不影響其正常的生長發育過程。

DNA損傷修復是在多種酶的復合作用下，生物細胞內的DNA分子受到損傷后恢復正常結構的現象。生物體上發現的DNA損傷修復相關基因甚多，而其中以上世紀90年代由美國華盛頓大學的Mary-Claire King教授發現的源于人體的一個DNA損傷修復基因 BRCA1(BReast CAncer)研究最為深入，BRCA1與另一個抗癌基因BRCA2一起，被稱為“染色體托管者”，它在調節生物體同源重組DNA損傷修復、胚胎生長、轉錄調控及泛素化等方面均有重要作用。含有BRCA1的蛋白復合物通過激活同源重組來啟動受損DNA 的修復過程,將維持基因組完整性和穩定性與抑制突變緊密聯系。許多研究結果表明，造成BRCA1基因功能喪失的突變均會引起細胞修復受損DNA功能的下降或缺失，進而導致體細胞突變的積累、染色體的異常分離和異倍化,為體細胞突變創造條件，最終導致生物體的正常生長發育受阻。

通過美國NCBI數據庫查詢可知，目前已經在約13560多種生物上發現了BRCA1或者其同源基因，其中絕大多數的研究來自哺乳動物或者他動物，在植物上的研究寥寥無幾，而水稻上更是至今尚無相關的報道。我們從水稻上發現了一個與人體抑癌基因BRCA1同源的基因Osbrca1，它的主要功能是進行水稻DNA復制雙鏈斷裂時的損傷修復。初步研究表明，該基因在水稻上的突變造成了水稻出現明顯的衰老和易感病的表型。由此可見，對于植物來說，DNA損傷修復對其衰老及免疫系統等的影響不容忽視，加之BRCA1對人類抑癌和免疫系統都具有重要影響，而Osbrca1在水稻尚無研究報道。鑒于此，研究者以 BRCA1在其他物種上的研究進展為基礎，可為水稻的生理及抗病及抗衰老育種研究開辟新的思路。

發明內容

本發明的目的在于提供一種水稻DNA損傷修復基因Osbrca1及其克隆和應用，該水稻DNA損傷修復基因與水稻的抗病和抗衰老相關，將該基因在水稻中過表達可提高水稻的抗病和抗衰老能力。

本發明技術方案如下：

水稻DNA損傷修復基因Osbrca1，其基因組核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的水稻DNA損傷修復基因Osbrca1的cDNA序列全長如SEQ ID NO：2所示。

用所述的水稻DNA損傷修復基因Osbrca1編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO： 3所示。

所述的水稻DNA損傷修復基因Osbrca1的克隆方法：根據Osbrca1參考基因序列設計引物，分段擴增后拼接，并分別以野生型品種云引、日本晴及Mic、突變體品種W14的 DNA為模板，進行克隆。

更進一步地，所述擴增時的程序為：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35 個循環；72℃5min，擴增時的反應體系為20ul，包含：DNA模板2ul(濃度為50ng/ul)，高保真DNA聚合酶KOD 0.4ul，KOD緩沖液4ul，引物F 0.5ul，引物R 0.5ul，滅菌水 12.6ul。